湘西地区猕猴桃溃疡病病原菌分离及其全基因组分析

通过了解湘西地区猕猴桃溃疡病致病菌分类地位和基因类型,初步探讨其致病的分子机理。采用纯培养法分离猕猴桃溃疡病菌;基于16S～23S rRNA基因内转录间隔序列进行病原菌的系统发育分析;通过基因组测序和生物信息学分析解析其致病的分子机理。从“米良1号”和“红阳”猕猴桃感病枝条中分离获得5株溃疡病菌,编号为L211、L212、L321、L322、L323;通过形态特征和16S～23S rRNA基因内转录间隔序列分析,鉴定5株细菌均为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae,Psa)。以菌株L211为代表进行体外猕猴桃枝条接种实验表明能引起典型溃疡病症状。通过菌株L211的全基因组测序和生物信息学分析,获得5 741条基因数目,长5 412 072 bp;基因功能注释发现菌株L211携带121种毒力因子、71个植物互作因子和77个耐药基因;同时,基因组单核苷酸多态性分析发现病原菌L211为基因Ⅲ型Psa。引起湘西地区猕猴桃溃疡病的病原菌是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因Ⅲ型,与国内外报道的引起猕猴桃溃疡病大流行的致病菌一致。猕猴桃溃疡病发病...     

子宫动脉化疗栓塞术治疗胎盘植入61 例的临床分析

目的:探讨子宫动脉化疗栓塞术治疗胎盘植入的临床疗效及预后。方法:以胎盘植入患者61例为研究对象,按治疗方式不同分为保守治疗组31例和化疗栓塞组30例。保守治疗组仅单纯口服米非司酮治疗,而化疗栓塞组采用子宫动脉化疗栓塞术进行治疗。比较两组患者的临床疗效、手术时间、出血量、输血量、住院时间、胎盘排出和月经复潮时间,术后并发症的发生情况,并随访术后1年患者的月经情况和妊娠情况。结果:经子宫动脉化疗栓塞术后29例成功止血,有1例未能止血而行子宫切除术。栓塞术后未出现器官局部缺血坏死、神经损伤等严重并发症,发热、下腹痛为常见并发症。而保守治疗组的31例患者中,因治疗失败导致切除子宫的7例,仅24例有效保留子宫,成功率仅77.4%,严重影响患者以后的生育能力。6例发生宫腔感染,4例发生宫腔粘连。子宫动脉化疗栓塞组β-HCG恢复正常时间、输血量、胎盘完全清除时间、月经异常的发生情况均优于保守治疗组,差异有统计学意义(P0.05)。对子宫动脉化疗栓塞术组患者进行为期1年的随访,14例患者在术后1个月后有胎盘组织自阴道排出,有11例患者2个月后发现胎盘残留,予以清宫术,除3例失访病例,其余患者在随访时间内恢复正常月经,并有2例再次妊娠者。结论:采用子宫动脉化疗栓塞术治疗胎盘植入,其术前准备时间和手术时间均短,出血控制迅速且并发症少,有助于保留患者的子宫,提高患者的生活质量。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

核酸恒温扩增技术研究进展

核酸恒温扩增技术在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。我们对核酸恒温扩增技术的最新进展作一简要综述,包括环介导恒温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增、切口酶核酸恒温扩增、依赖解旋酶的恒温扩增、转录依赖的扩增、杂交捕获法、转录介导的扩增等的原理、优缺点及应用。     

沙眼衣原体感染后大鼠输卵管与植物凝集素BS-1结合的糖蛋白的变化

目的研究沙眼衣原体感染后输卵管与植物凝集素BS-1结合的糖蛋白的变化.方法取25只成熟Wistar雌性大鼠随机分为实验组和对照组,每组5只.对照组接种2SP代替沙眼衣原体,其余每组大鼠均在卵巢囊接种沙眼衣原体D型株.分别于感染后3,5,7,14d处死动物,取输卵管,观察大鼠输卵管与植物凝集素BS-1结合的糖蛋白在感染后不同天数发生的改变,其变化可通过荧光显微镜观察与植物凝集素BS-1结合后的荧光强度来检测,并采用HPIAS-1000图文分析系统进行定量分析和SPSS11.0统计软件作统计分析.结果输卵管受损部位主要在粘膜层,富含N-乙酰-D-半乳糖胺的糖蛋白随感染的天数不同,其变化有所不同,尤其以输卵管峡部变化明显.图像分析结果显示:感染第7d时其分泌量最低,感染后第14d其分泌量逐渐恢复,且各组间差异有显著性意义(P<0.05).结论输卵管是精子与卵子结合的地方,也是胚胎早期发育的场所.富含N-乙酰-D-半乳糖胺的糖蛋白可通过参与精卵结合、受精卵卵裂和早期胚胎发育等方式,对受精卵及早期胚胎发挥保护作用.     

稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞单克隆株的建立

目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)的PK15细胞系。方法:以实验室前期构建的pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞中的表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F的细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株中pA3F的表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10~8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白的表达;经Western印迹鉴定,筛选得到的单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3F的PK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下的免疫逃逸机制奠定了基础。     

干扰血红素加氧酶-1改善黑色素瘤细胞对顺铂耐药性的机制研究

目的:探讨血红素加氧酶-1(HO-1)对皮肤黑色素瘤细胞耐药性的影响并分析其分子机制。方法:采用慢病毒载体介导RNA干扰HO-1稳定低表达的恶性皮肤黑色素瘤细胞A375(KD组),用RT-PCR和Western印迹验证其干扰效率;CCK-8法检测HO-1敲减后细胞的增殖情况及对药物顺铂的敏感性变化;流式细胞术检测顺铂对细胞凋亡的影响;RT-PCR及Western印迹检测顺铂处理的HO-1稳定敲减细胞系中凋亡相关基因的变化。结果:构建了HO-1稳定低表达的A375细胞株,敲低HO-1明显抑制细胞增殖;敲低HO-1后细胞对顺铂的敏感性增加,在低浓度顺铂(0.25～6μg/m L)处理的情况下,A375-sh HO-1细胞抑制率比正常A375细胞高8倍以上;顺铂处理后,在RNA水平和蛋白水平上A375-sh HO-1细胞中凋亡相关基因Bax、active Caspase-3显著增加,并降低Bcl-2的表达。结论:RNA干扰抑制HO-1基因表达能够增强皮肤黑色素瘤细胞A375对顺铂的敏感性。     

IgA肾病患者扁桃体中树突状细胞和高内皮小静脉关系的研究

摘要 目的：探讨IgA肾病（IgA nephropathy,IgAN）患者扁桃体树突状细胞（dendritic cells,DCs）与高内皮小静脉(High endothelial venules, HEVs)的关系。方法：我们检测了25例IgAN患者的扁桃体,并以复发性扁桃体炎（Recurrent tonsilitis, RT）患者的扁桃体22例作为对照。用免疫组化方法检测DCs标志物CD208,用实时聚合酶链反应检测淋巴毒素β（ Lymphotoxin β,LT-β） mRNA水平,用Hematoxylin-eosin染色确定HEVs。结果：IgAN患者扁桃体CD208+DCs明显高于对照组（P<0.001）。IgAN患者扁桃体HEVs明显高于对照组（P<0.001）。此外, IgAN患者扁桃体LT-mRNA水平明显高于对照组（P<0.001）。IgAN 扁桃体中CD208+DC与HEVs明显成正相关（r=0.7427,P<0.001)。结论：扁桃体CD208+DCs可能通过HEVs导致IgAN患者扁桃体免疫的异常而促进肾脏疾病的发展。     

Caveolin-1在围植入期小鼠子宫内膜组织中的动态变化

目的检测caveolin-1在胚胎植入过程中小鼠子宫内膜组织中的表达,探讨其在胚胎植入过程中的作用。方法选择成年雌性昆明小白鼠42只,随机均分为7组(处于动情期的未孕组、妊娠3.5天组、妊娠4.5天组、妊娠5.5天组、妊娠6.5天组、妊娠7.5天组、妊娠9天组),采用免疫组织化学和RT-PCR方法检测子宫内膜组织中caveolin-1蛋白及mRNA水平在围植入期的变化。结果 (1)caveolin-1在胚胎植入前期(0d、3.5d)小鼠子宫内膜组织中的表达高于胚胎植入期(4.5d、5.5d、6.5d),差异有显著性(P<0.05)。(2)caveolin-1在胚胎植入后期(7.5d、9d)小鼠子宫内膜组织中的表达高于胚胎植入期(4.5d、5.5d、6.5d),差异有显著性(P<0.05)。(3)caveolin-1在胚胎植入后期小鼠子宫内膜组织中的表达略高于胚胎植入前期,但差异无显著性(P>0.05)。结论 Caveolin-1在胚胎植入前期和后期均高表达,植入期低表达。这种变化提示caveolin-1是影响胚胎植入的重要因素之一。     

核酸试纸条在检测转EPSPS基因作物中的应用

目的:建立快速、简便和特异的检测转EPSPS基因作物的方法。方法:针对转EPSPS基因作物外源基因cp4-EPSPS的8个区域,设计2对特异性引物和1对环引物,对反应体系中的MgSO4、内引物、环引物、甜菜碱、dNTP浓度和反应温度等条件分别进行优化,并用核酸试纸条对扩增产物进行检测,建立用于检测转EPSPS基因作物的环介导等温扩增方法(LAMP)。结果:用建立的LAMP方法检测转EPSPS基因作物时,在64℃恒温反应30 min,即可根据试纸条显色直接观察结果;该方法具有高度特异性,可检测到10个拷贝的EPSPS DNA。结论:LAMP方法可快速、灵敏、特异、经济地检测转EPSPS基因作物,在基层和实验室都具有良好的应用前景。