人DNA 拓扑异构酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ（hTopo Ⅰ）为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopo Ⅰ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达,表达产物可分泌到发酵上清,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母（SMD-hTopoI）分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母（X33-hTopoI和KMhTopoI）更高。通过发酵条件的优化,使用BMMY（pH 7.25）,于20℃,每隔24h补加0.5% (V/V)的甲醇和3% (V/V)的营养液,SMD-hTopo Ⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力（43000u/mL）,发酵上清中hTopo Ⅰ可达11 mg/L,约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达的hTopo Ⅰ为91kD蛋白,无糖基化修饰。     

里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达

内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足,通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体p PIC9K-eg2,并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子,利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115-EGⅡ。重组酶的酶学性质分析显示,该酶分子量50 k Da、最适p H(p H 4.5)略有降低及最适反应温度为60℃,专一性地作用于非结晶纤维素,与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化,该菌摇瓶培养条件:培养温度28℃、起始p H 5.0、接种量2%、每24 h添加甲醇1.5%(V/V)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4 g/L,发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/m L。进一步上罐(5 L)发酵180 h,该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/m L,蛋白含量达到4.16 g/L。重组毕赤酵母P.pastoris GS115-EGⅡ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌,该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

血红蛋白基因在产CBHⅡ毕赤酵母工程菌中的表达

目的:提高毕赤酵母工程菌P.pastoris-CBHⅡ液体发酵产纤维二糖水解酶(CBHⅡ)的能力。方法:分别构建了用于胞外及胞内表达透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA-vhb与pPICZαA(-s)-vhb。通过电转化将两种质粒转化巴氏毕赤酵母重组菌体P.pastoris-CBHⅡ菌株,经过筛选分别获得可正确表达具有生物活性的VHb蛋白的重组菌株P.pastoris-CBHⅡ-vhb(胞内表达VHb)及P.pastoris-CBHⅡ-vhb(-s)(胞外表达VHb)。结果:摇瓶发酵实验表明,血红蛋白在贫氧条件下可促进CBHⅡ的分泌表达,培养液上清的CMC酶活分别从出发菌株P.pastoris-CBHⅡ的1.81U/ml提高到2.04U/ml(胞内表达VHb)与1.93U/ml(胞外表达VHb)。VHb蛋白胞内表达菌株比胞外表达菌株效果更明显。     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.     

洛伐他汀酰基转移酶在毕赤酵母中的高效表达

目的:构建并筛选高效表达洛伐他汀酰基转移酶(Lov D)的毕赤酵母重组菌株。方法:将突变的Lov D基因克隆到毕赤酵母胞外表达质粒p PIC9K和胞内表达质粒p AO815中,将重组表达质粒电转入毕赤酵母GS115中,得到毕赤酵母重组菌株,通过摇瓶发酵筛选高酶活力的重组菌株;在此基础上,研究重组菌在5L发酵罐中的高密度发酵,并将所得酶液进行辛伐他汀催化反应。结果:p PIC9K-Lov D胞外表达重组菌的酶活是p AO815-Lov D胞内表达重组菌的3倍。筛选到酶活高的p PIC9K-Lov D-3菌株进行5L发酵罐放大实验,经过96 h的甲醇诱导表达,酶活可达609.3 U/L;发酵所得酶液冻干后进行酶功效实验,反应45 h后,其底物转化率可达96%以上。结论:构建的毕赤酵母胞外表达菌株可高效表达洛伐他汀酰基转移酶,培养液上清杂蛋白较少,有利于后续分离和纯化,为洛伐他汀酰基转移酶的工业化生产奠定了基础。     

对SDS稳定的V8(V125T)蛋白酶突变体的高效表达及性质研究

谷氨酰内切酶能特异性切割谷氨酸、天冬氨酸残基羧基端结合的肽键。将含有V8蛋白酶突变体(V125T)基因的表达质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3),在50L发酵罐中发酵,融合蛋白为可溶性表达,可得菌湿重50g/L,相对蛋白表达量为33%。融合蛋白采用GST亲和纯化、肠激酶激活、DEAE-FF阴离子交换层析,得到纯的V8(V125T)突变体,经纯化后可获得0.998mg蛋白/g菌(湿重),比活为13.47 U/mg pro.纯化过程的酶活回收率达到了97.9%。对纯酶进行酶学性质分析,以Z-Phe-Leu-Glu-p NA作为底物测得V8(V125T)蛋白酶的Km为0.339mmol/L,Vmax为16.642μmol/min。其最适pH为8.0,在pH4.0~10.0之间较稳定;最适反应温度在45℃,12h内在4~35℃有很好的温度稳定性;25℃条件下1mmol/L的金属离子对酶具有不同程度的影响,其中Fe~(3+)的抑制作用最强;2mol/L尿素及1mmol/L EDTA对酶活性无影响,在0.1%SDS中保存12h、在0.5%SDS中4h和在1%SDS中1h,活性均能维持90%以上,在0.5%,0.1%SDS保存12h,仍能保持80%和64%的活性,与未突变的重组V8蛋白酶相比,该突变体对SDS的耐受性得到极大提高。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶在酵母系统中的可溶性表达

利用毕赤酵母系统表达具有催化活性的丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白酶 .将PCR直接扩增的病毒NS3丝氨酸蛋白酶基因和重组的带有辅酶的单链NS3 NS4A蛋白酶基因 ,分别插入表达载体pPICZαA的EcoRⅠ和XbaⅠ克隆位点 ,转化毕赤酵母GS115 ,可溶性表达NS3蛋白酶和单链NS3 4A蛋白酶 ;ELISA法测定表达蛋白酶的抗原性 ;原核高效表达载体pBVIL1表达酶切底物NS5A B片段 ,体外与蛋白酶共同温育 ,SDS PAGE鉴定蛋白酶催化活性 .载体测序结果表明 ,重组载体pPICZαA NS3和pPICZαA NS3 4A中的目的基因序列插入正确 ;SDS PAGE结果显示 ,培养物上清中存在分泌型目的蛋白带 ;ELISA结果证实 ,表达蛋白与HCV阳性血清有结合活性 ;蛋白酶与底物NS5A B片段不同作用时间的SDS PAGE ,看到约 2 4kD处底物条带的分解 .说明用毕赤酵母表达系统成功地表达了可溶性HCVNS3和单链NS3 4A蛋白酶 ;两种结构形式的蛋白酶在体外系统中都有催化活性 ,同时也都具有抗原性 .该研究为大量和方便地获得有催化活性的HCVNS3蛋白酶提供了有效途径 .     

新疆家蚕抗菌肽在毕赤酵母中表达及活性研究

目的:在毕赤酵母中表达新疆家蚕抗菌肽基因(Cecropin-XJ)并检测其活性.方法:根据作者实验室已克隆获得的新疆家蚕抗菌肽(Cecropin-XJ)基因设计引物,通过PCR方法扩增Cecropin-XJ,将PCR产物和表达载体pPIC9K用EcoR Ⅰ及Not Ⅰ双酶切,构建重组表达质粒pPIC9K-(Cecropin-XJ),酶切及测序正确后,电转化到毕赤酵母GS115,对分泌表达的重组蛋白进行活性检测.结果:PCR扩增获得192 bp Cecropin-XJ,成功构建pPIC9K-Cecropin-XJ,优化诱导条件证明在pH 6的BMMY培养液中,0.5%甲醇诱导约48h后,获得的表达产物活性较强,对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抗菌活性,在100℃条件下,其活性可维持100min以上.结论:新疆家蚕抗菌肽在毕赤酵母中分泌表达,为大规模发酵生产奠定了基础.     

共表达HAC1和分子伴侣基因对甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响

为了提高甘露聚糖酶ManA在毕赤酵母中分泌表达的酶活,选择毕赤酵母内质网未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)激活调控因子HAC1与5种毕赤酵母蛋白折叠相关的分子伴侣ERO1、PDI、PDI1、CPR5、BiP,通过构建pPICZA-HAC1等6种胞内表达重组质粒,分别电转化至分泌表达ManA的毕赤酵母重组菌中胞内共表达,并分析其重组菌摇瓶发酵时ManA表达的影响。结果发现在摇瓶发酵水平,胞内共表达HAC1、ERO1、PDI的重组菌发酵上清液中的ManA酶活力分别提高了26%、15%、20%,其重组菌发酵上清液的酶活力分别达到1 014 U/mL、925 U/mL、965 U/mL。通过对各重组菌上清液酶活力、胞内滞留酶活力、上清液蛋白浓度数据进行分析,进一步选择将HAC1、ERO1、PDI进行两基因或三基因组合,并分别在分泌表达ManA的重组菌胞内共表达,但各共表达重组菌发酵上清液的酶活力都没有进一步的提升。单独共表达HAC1或者分子伴侣ERO1、PDI可以辅助ManA的正确折叠,提高其蛋白表达。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因（BGL1）,长度为2596 bp,连接到pGEM-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框,构建成重组质粒pSHL9K.通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株.重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4.培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL.     

人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体（HBscFv）。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因,亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中,线性化后转化P. pastorisGS115;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现,重组HBscFv可以在α因子的引导下,分泌至培养基中,产量为80mg/L;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性,活性总量在诱导培养72h后达最高峰,在诱导培养后期,HBscFv活性下降;PAS糖显色结果表明,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。     

鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

为了在毕赤酵母中表达鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidaseB,proCPB)蛋白,以RT-PCR法从SD鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,PEG1000介导转入毕赤酵母GS115细胞,在甲醇的诱导下,实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达。通过发酵条件的优化,使用BMGY(pH6·0)培养基,添加0·5%的酪蛋白水解物,于28℃,在起始OD600达10·0时,每隔12h补加0·5%的甲醇,重组酵母GS115-proCPB表达的产物量可达到最高(500mg/L),表达时间可达120h,表达的目的蛋白占总蛋白的94%以上。通过纯化条件的优化,采用两步疏水层析,可使目的蛋白的纯度达96%以上,蛋白得率达38%,重组proCPB活化后所得CPB的比活力可达110u/mg(CPB标准品为180u/mg)。相对分子量测定表明重组蛋白的分子量与理论值极相近,N-端氨基酸测序进一步表明proCPB基因在毕赤酵母中得到了正确的表达和翻译后加工修饰。     

猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达

将去除信号肽的猪干扰素-γ（PoIFN-γ）基因置于酿酒酵母α因子分泌信号的DNA序列后, 构建成pPIC9K-α-PoIFN-γ分泌型重组表达载体, 电转化导入毕赤酵母GS115中,经G418筛选后获得2株多拷贝插入的重组子。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17kD和23kD左右的PoIFN-γ特异蛋白,其表达量为108mg/L,占培养液总蛋白的60%。实验首次在毕赤酵母表达系统中实现了PoIFN-γ基因的分泌表达。     

High-level expression of Candida parapsilosis lipase/acyltransferase in Pichia pastoris

Candida parapsilosis has been previously shown to produce a lipase/acyltransferase (EC 3.1.1.3) that preferentially catalyses transfer reactions such as alcoholysis over hydrolysis in the presence of suitable nucleophiles other than water, even in aqueous media (aw > 0.9 ). This enzyme has been shown to belong to a new family of lipases. The present work describes the cloning of the gene coding for this lipase/acyltransferase in the yeast Pichia pastoris and the heterologous high-level expression of the recombinant enzyme. The lipase/acyltransferase gene, in which the sequence encoding the signal peptide was replaced by that of the alpha-factor of Saccharomyces cerevisiae, was placed under the control of the methanol inducible promoter of the alcohol oxidase 1 gene (AOX1). A transformed P. pastoris clone, containing five copies of the lipase/acyltransferase gene, was selected for the production of recombinant enzyme. The fed-batch culture supernatant contained 5.8 gl(-1) (weighted) of almost pure recombinant lipase/acyltransferase displaying the same catalytic behavior as the original enzyme.     

人β-分泌酶 (BACE1) 在毕赤酵母中分泌表达及纯化

为了获得活性良好的重组人β-分泌酶 (β-secreatase, BACE1),用于研究其与抑制剂的作用模式,构建了携带β-分泌酶proBACE1和BACE1编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46,通过电击法转入毕赤酵母GS115中,分别得到重组子9k-B22和9k-B46。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达,结果显示9k-B22的上清活性明显高于9k-B46的上清活性。9k-B22表达上清浓缩后经HisTrap亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的BACE1活性, SDS-PAGE/高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白,并且其糖基侧链可以被Endo Hf完全切除,得到50 kDa左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现,这两个蛋白分别与proBACE1和BACE1匹配。活性检测发现糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK-293细胞表达的商品BACE1,这说明糖基化及其类型对BACE1的活性非常重要。然而已知的BACE1抑制剂对三者的抑制率无显著差异,这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化BACE1纯化产量提高到1 mg/L,这为发现并优化BACE1新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

利用重叠PCR技术在体外拼接IFN β和HSA基因,将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNβ-HSA表明该蛋白分子量约为90kDa且具有HSA的抗原性;用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU/ml。