重组人核苷二磷酸激酶A的理化性质

对重组人核苷二磷酸激酶A（rhNDPK-A）进行纯化,并对重组产物的理化性质及在溶液中的聚合状态进行鉴定。NDPK-A工程菌发酵后的菌体高压匀浆,然后微孔过滤、超滤浓缩,所得样品经DEAE阴离子交换、Cibacron Blue亲和层析、分子筛层析三步纯化后,以SDS-PAGE和RP-HPLC分析纯化产物的纯度,RP-HPLC测定酶活性。合格制品以基质辅助激光解析飞行时间质谱测定相对分子质量（MW）;Edman降解法测定N末端序列;多角度激光散射法测定重组产物在溶液中的表观分子量。结果表明,rhNDPK-A纯化产物的SDS-PAGE纯度为97.3%,RP-HPLC纯度为99.2%;比活性为（900±100）u/mg;单体相对分子质量为17017,与NDPKA分子量理论值相差132。测序结果表明,rhNDPK-A N末端缺失Met残基,其理论分子量为17017,与飞行质谱测定结果完全一致。表观分子量测定结果表明,rhNDPK-A在溶液中形成六聚体,表观分子量为102kD。上述结果说明, NDPK-A重组产物具与天然产物相同的自发形成六聚体性质,这为NDPK-A新药开发和机理研究打下了良好基础。     

人重组核苷二磷酸激酶α亚基对MCF-7/S的影响

软琼脂集落形成实验检测rhNDPK -α对乳腺癌细胞株MCF - 7 S集落形成率的影响 ,结果表明 ,MCF - 7 S集落形成率随rhNDPK -α浓度增高下降 ,提示rhNDPK -α可能具有抑制乳腺癌细胞株MCF - 7 S转移作用 ;MTT法检测rhNDPK -α分别联用丝裂霉素C、5 -氟尿嘧啶和千金藤碱对MCF - 7 S的增殖影响 ,结果显示 ,rhNDPK -α分别联用三种化疗物与这三种化疗药物单独作用于MCF - 7 S无明显差异 (P >0 0 5 ) ,提示rhNDPK -α对丝裂霉素C、5 -氟尿嘧啶和千金藤碱没有增敏作用。     

核苷二磷酸激酶A的异构及其分子机制

对核苷二磷酸激酶A(NDPKA)的异构及其分子机制进行研究.还原和非还原SDSPAGE观察重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPKA)的异构;RPHPLC分析rhNDPKA异构体的反相色谱行为,并测定rhNDPKA异构体的酶活性;多角度激光散射法测定rhNDPKA异构体在溶液中的表观分子量;飞行质谱分析异构体的质量肽谱.结果发现,rhNDPKA在非还原SDSPAGE上表现为4条带,对应于NDPKA的氧化型、还原型、氧化型二聚体和还原型二聚体,其分子量分别为18.1kD、21.3kD、35.2kD和38.3kD.RPHPLC发现,还原型rhNDPKA和氧化型rhNDPKA疏水性有差异.新鲜制备的rhNDPKA在纯水溶液中,经空气氧化后,逐渐由还原型向氧化型过渡,而还原剂或生理盐水可使rhNDPKA稳定于还原型或氧化型.酶活测定结果表明,还原型rhNDPKA比活性为1965±166Umg,氧化型rhNDPKA比活性为974±53Umg.多角度激光散射检测发现,还原型rhNDPKA在溶液中仍可形成六聚体.质量肽谱结果证明,在氧化型rhNDPKA中,C4和C145位巯基形成二硫键,而C109位巯基游离存在.根据本文所确定的NDPKA单体中的二硫键位置,推导出rhNDPKA单体异构体和二聚体异构体的变构原理,这为进一步研究NDPKA的多能性调节机制打下了良好基础.     

siRNA干扰HSV1 gD糖蛋白基因的研究

以HSV1 gD糖蛋白基因为靶点,设计合成5对siRNA,并构建pEGFP-N1-gD融合表达质粒,脂质体法共转染Vero细胞,利用绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的特征,流式细胞仪筛选特异沉默gD表达的siRNA。然后有效siRNA转染Vero细胞并感染HSV1,通过空斑减数实验,Real-time PCR和子代病毒滴度评价其对HSV-1感染的作用。结果显示siRNA能有效抑制gD-EGFP融合蛋白和感染细胞内gD糖蛋白的表达,但对HSV-1的感染性无明显抑制作用,故选择gD作为siRNA抗病毒靶点还需进一步的论证。     

人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体（HBscFv）。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因,亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中,线性化后转化P. pastorisGS115;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现,重组HBscFv可以在α因子的引导下,分泌至培养基中,产量为80mg/L;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性,活性总量在诱导培养72h后达最高峰,在诱导培养后期,HBscFv活性下降;PAS糖显色结果表明,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。     

SARS灭活病毒免疫兔后IgG特异抗体应答

将灭活的SARS冠状病毒抗原每隔两周多点注射免疫兔,共免疫3次,以观察SARS灭活病毒免疫兔后兔血清中IgG特异性抗体的应答变化。免疫前及第一次免疫后第8、14、21、28、35天耳静脉取血,分离血清。间接ELISA法测得血清中特异性IgG抗体持续升高,并表现出一定的剂量依赖性：第35天G1、G2、G3组血清IgG抗体滴度分别为1：51200、1：49600、1：25600;中和试验测得G1组第28天血清样品中和抗体效价为1：2560;蛋白芯片测得M、N、3CI,、S1、S2、S3、S4等病毒蛋白抗原都可特异性结合抗血清中的IgG抗体,但是不同蛋白抗原结合能力有差别。因此可认为SARS灭活病毒经皮下注射免疫兔后,可诱导全身性IgG抗体应答,产生SARS冠状病毒特异性抗体。