里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ在毕赤酵母中的高效表达

本工作采用巴氏毕赤酵母Pichiapastoris表达系统进行了里氏木霉Trichodermareesei纤维二糖水解酶Ⅱ(CellobiohydrolaseII)的表达。用RT-PCR的方法从经稻草粉诱导的里氏木霉培养物中分离出纤维二糖水解酶Ⅱ的基因,将其插入到巴氏毕赤酵母的表达载体pPICZαA中,并使之处于α-因子信号肽序列的下游,得到重组质粒pPICZαA-cbh2。通过电穿孔的方法用线性化的pPICZαA-cbh2转化巴氏毕赤酵母GS115菌株,经过大量筛选后得到可以高效表达纤维二糖水解酶的毕赤酵母菌株P.pastorisCBHⅡ1。在甲醇诱导的条件下培养P.pastorisCBHⅡ1,培养液中的CMC活性可达到3.82U/mL,SDS-PAGE分析结果表明纤维二糖水解酶在P.pastorisCBHⅡ1中的表达量远远高于里氏木霉。对表达产物进行了LC-MS分析,结果表明所表达的蛋白为里氏木霉的纤维二糖水解酶。     

黄瓜膨胀素的重组表达及活性分析

目的:提高纤维素的酶水解效率和开发高效的纤维素酶水解过程。方法:采用RT-PCR方法从黄瓜胚轴细胞中分离了膨胀素S1的cDNA,并使之与毕赤酵母表达质粒pPICZ(A连接,形成重组质粒pPICZ(A-exs1。通过电转化方法,用质粒pPICZ(A-exs1转化巴氏毕赤酵母GS115,得到重组菌株P.pastoris-exs1。在该重组菌株中,膨胀素的基因通过同源重组整合在毕赤酵母的染色体上,并处于毕赤酵母甲醇氧化酶启动子的下游。重组菌株P.pastoris-exs1在甲醇诱导下可合成并分泌膨胀素。结果:培养上清液没有纤维素酶活性,但具有破坏滤纸纤维素结晶结构的能力。培养上清液与里氏木霉纤维素酶等量混合后,可使纤维素酶的滤纸酶活力提高50%。结论:采用巴氏毕赤酵母GS115重组成功表达了黄瓜膨胀素,其表达产物可以促进纤维素酶对滤纸的水解。     

碱性成纤维细胞生长因子制剂稳定性的研究

本研究通过MTT法检测bFGF的活性,研究了不同温度下四种制剂中bFGF的稳定性。结果得到,bFGF在2．0mol／L NaCl,0．05mol／L PB溶液(pH7.2)中,-20℃下贮藏6个月活性没有明显的下降;bFGF水剂贮藏在4℃下,bFGF活性随贮藏时间延长逐步下降,单位活性bFGF用量由0.4ng／mL下降为0．9ng／mL,室温下bFGF的活性丧失快于4℃下贮藏,3个月后bFGF单位活性用量由0．4ng／mL下降为1．0ng／mL。而乳霜剂和胶束剂中的bFGF在两种温度下贮藏一个月后,均检测不到对细胞生长的刺激作用。说明低温有利于制剂中bFGF的稳定,乳霜剂和胶束剂中的bFGF稳定性不好。     

碱性纤维素酶革兰氏阴性菌株筛选及酶学性质研究

用CMC平板筛选方法,从造纸厂碱性淤泥中获得透明圈直径大于30mm的产碱性纤维素酶革兰氏阴性菌H8005。液体摇瓶培养产生碱性CMC酶活力高达4．2IU／mL。酶学性质初步研究显示,H8005产生的CMC酶反应的pH值以8．0左右为适;在碱性条件下具有较高的酶活和一定的稳定性;反应温度以55℃左右为宜;且具有较好的温度稳定性。Mn^2＋与Fe^3＋对酶反应有促进作用,Cu^2＋和Pb^2＋对酶反应有抑制作用。该菌产生的纤维素酶在棉织品的水洗整理及洗涤剂工业中具有非常良好的应用前景。     

水螅摄食中的特殊行为

取经中性红活染后的杆吻虫喂水螅,仔细观察了水螅的摄食行为。结果表明,水螅垂唇端部能够相互识别出同类;水螅的垂唇与胃区能协力把杆吻虫吞入胃腔,触手经常随食物进入胃腔;吞食时经常出现头部内翻或外翻;个体间及其成体与芽体间常出现争夺食物的现象,当垂唇端部互不相触时,体型较大的个体常常把较小个体或芽体连同食物一起吞食;垂唇内胚层腺细胞对食物有消化作用,对同类无伤害;水螅的神经系统已有初步的整合功能。     

血红蛋白基因在产CBHⅡ毕赤酵母工程菌中的表达

目的:提高毕赤酵母工程菌P.pastoris-CBHⅡ液体发酵产纤维二糖水解酶(CBHⅡ)的能力。方法:分别构建了用于胞外及胞内表达透明颤菌血红蛋白(VHb)基因的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA-vhb与pPICZαA(-s)-vhb。通过电转化将两种质粒转化巴氏毕赤酵母重组菌体P.pastoris-CBHⅡ菌株,经过筛选分别获得可正确表达具有生物活性的VHb蛋白的重组菌株P.pastoris-CBHⅡ-vhb(胞内表达VHb)及P.pastoris-CBHⅡ-vhb(-s)(胞外表达VHb)。结果:摇瓶发酵实验表明,血红蛋白在贫氧条件下可促进CBHⅡ的分泌表达,培养液上清的CMC酶活分别从出发菌株P.pastoris-CBHⅡ的1.81U/ml提高到2.04U/ml(胞内表达VHb)与1.93U/ml(胞外表达VHb)。VHb蛋白胞内表达菌株比胞外表达菌株效果更明显。     

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

碱性纤维素酶及其应用的研究进展

碱性纤维素酶在碱性条件下具有内切β-1,4葡萄糖苷酶活力,在加酶洗涤剂等行业具有重要的应用价值。目前已发现由芽孢杆菌和链霉菌产生的多种碱性纤维素酶,其中大部分的基因已被克隆、测序和表达,其催化反应特性、反应机理和应用也得到了较深入的研究。从碱性纤维素酶的产生菌、酶反应特性和反应机理、碱性纤维素酶的基因克隆和表达,以及碱性纤维素酶的应用等几个方面,介绍了有关碱性纤维素酶的最新研究进展。     

碱性纤维素酶革兰氏阴性菌株筛选及酶学性质研究*

用CMC平板筛选方法,从造纸厂碱性淤泥中获得透明圈直径大于30mm的产碱性纤维素酶革兰氏阴性菌H8005。液体摇瓶培养产生碱性CMC酶活力高达4.2 IU/mL。酶学性质初步研究显示,H8005产生的CMC酶反应的pH值以8.0左右为适;在碱性条件下具有较高的酶活和一定的稳定性;反应温度以55℃左右为宜;且具有较好的温度稳定性。Mn²⁺与Fe³⁺对酶反应有促进作用,Cu²⁺和Pb²⁺对酶反应有抑制作用。该菌产生的纤维素     

神经肽Y、钙基因相关肽和P物质在甲状腺中的分布及其在甲亢状态下的变化(英文)

以往的研究表明,甲状腺中分布有肽能神经,包括神经肽Y(NPY)能神经、P物质(SP)能神经和脑肠肽(VIP)能神经.这些神经纤维的终末与血管和甲状腺的滤泡接触.一般认为,甲状腺的功能活动主要受下丘脑-垂体-甲状腺轴的调节,有关神经肽的调节,尤其是在甲亢状态下的调节尚不清楚.本研究以SD大鼠为实验动物,通过T4注射建立甲亢动物模型.使用免疫组化技术对NPY、CGRP和SP 在实验与对照动物的分布进行形态学研究,使用放射免疫测定技术对模型动物与对照动物甲状腺中的NPY、CGRP和SP进行定量研究.免疫组化技术发现NPY阳性神经纤维密集环绕小血管,其末端与血管内皮紧密联系,一些NPY阳性神经走行于滤泡间的结缔组织中,其末端与滤泡上皮接触;有SP阳性神经纤维走行于滤泡间的结缔组织中,其末端与滤泡上皮接触;CGRP阳性细胞分布于滤泡间的结缔组织中,或滤泡上皮细胞之间.放射免疫测定表明甲亢大鼠NPY、SP水平高于对照大鼠,CGRP水平低于对照大鼠.结果表明,在甲亢状态下,机体通过血管收缩介质NPY、SP的增多与血管舒张介质CGRP的减少,控制甲状腺素进入血液循环,这是机体在病理过程中的自稳机制之一.