小反刍兽疫病毒Ｍ基因的截短表达及 多抗血清的制备

目的截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒M基因的截短表达及多抗血清的制备

目的截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。     

拟南芥WUSCHEL蛋白的原核表达、亲和纯化和多克隆抗体制备

本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6),优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系,将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白,经尿素梯度透析复性溶解,免疫新西兰大白兔,成功制备了WUS蛋白多克隆抗体。通过琼脂糖免疫扩散检测确定了抗血清效价和特异性,并以斑点杂交和Western blotting检验其灵敏性。结果表明,成功构建的拟南芥WUS原核表达载体,在E.coli中以0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28°C诱导表达10h后,融合蛋白得到高水平表达,亲和纯化后目标蛋白纯度达96%以上,所制备的多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用来检测纳克级蛋白抗原。     

家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测

制备家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体,并对该抗体进行检测。利用PCR技术从家蚕中克隆GAPDH基因,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白并纯化。纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备GAPDH多克隆抗体。用酶联免疫吸附法和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功构建GAPDH/p ET-28a原核表达载体,获得高纯度的GAPDH重组融合蛋白;经SDS-PAGE和抗His单抗检测,纯化后蛋白的分子量大小与预测的一致;以该蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对新西兰大白兔进行免疫,获得GAPDH多克隆抗体血清。酶联免疫吸附检测结果表明,GAPDH抗体的效价为1:8000,并能与天然家蚕蛋白特异性结合。成功制备了家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体,为深入研究家蚕中不同蛋白的生理功能和作用奠定了坚实的基础。     

中华绒螯蟹组蛋白H3基因保守序列的克隆、表达及抗体制备

为了研究组蛋白H3在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精子发生中的动态特征,采用PCR技术扩增中华绒螯蟹H3基因编码区的DNA片段,将其重组至含有6个His标签序列的原核表达质粒pET-30a(+)上,转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中,以0.2 mmol/L的异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生pET-30a-H3重组蛋白。SDS-PAGE表明,重组菌成功表达出了分子量约为21 ku的目标蛋白质,融合蛋白以上清和包涵体的形式存在。采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备兔抗血清。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体具有较好的特异性。至此,成功地克隆了中华绒螯蟹H3编码区基因并制备了多克隆抗体,为进一步研究其在精子发生中的动态特征提供了基础。     

人生长分化因子15的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化、鉴定人生长分化因子15(GDF-15),制备其多克隆抗体。方法:从人结肠癌细胞系HT29的cDNA扩增出GDF-15基因片段并插入pET-32a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组GDF-15,用镍亲和柱纯化,SDS-PAGE、Western印迹鉴定重组蛋白。用纯化的重组GDF-15免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,鉴定并检测其效价。结果:制备了pET-32a(+)-GDF-15表达载体;经IPTG诱导重组蛋白表达后,采用Ni亲和柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定;免疫BALB/c小鼠后获得了GDF-15多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶100000,并应用于肿瘤细胞的GDF-15检测中。结论:用基因工程和免疫学方法制备了重组人GDF-15及其多克隆抗体,为后续的分子机制和靶向治疗研究奠定了基础。     

小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。     

果蝇Domeless蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

在果蝇(Drosophila melanogaster)的研究中发现Domeless接受器参与发育期间的JAK/STAT信号调节,在心脏疾病的发生机制中发挥重要作用.为了克隆Domeless,我们利用生物信息学选择果蝇Domeless基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E.coli(Escherichia coli)中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-Domeless融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western blot检测抗体的效价和特异性.获得了Domeless原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Domeless多克隆抗体,为后续Domeless功能研究奠定了基础.     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP53B原核表达及抗血清的制备

【目的】研究对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白sVP53B克隆、表达、纯化及抗血清制备。【方法】根据WSSV囊膜蛋白基因序列,设计引物,PCR扩增出功能序列(Svp53B),构建到pET-16b载体后,转化至大肠杆菌Rosetta 2诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting检测优化表达。表达产物采用Ni-NTA琼脂糖磁珠进行纯化、割胶回收融合蛋白,以纯化的Svp53B-his为抗原,免疫兔子获得多克隆抗体,通过间接ELISA检测抗体的效价。【结果】构建重组质粒pET-16b-Svp53B,在大肠杆菌Rosetta 2中以1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,主要以包涵体形式表达。纯化包涵体蛋白免疫兔子,获得多克隆血清,效价达到1:150 000。【结论】原核表达并纯化得到高纯度的WSSV囊膜蛋白sVP53B,制备的兔源多克隆血清亲和力高、特异性好,这对后期进一步研究VP53B与经口侵染相关功能奠定了基础。     

果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。     

Vaccination with Recombinant Adenoviruses Expressing the Peste des Petits Ruminants Virus F or H Proteins Overcomes Viral Immunosuppression and Induces Protective Immunity against PPRV Challenge in Sheep

Peste des petits ruminants (PPR) is a highly contagious disease of small ruminants caused by the Morbillivirus peste des petits ruminants virus (PPRV). Two recombinant replication-defective human adenoviruses serotype 5 (Ad5) expressing either the highly immunogenic fusion protein (F) or hemagglutinin protein (H) from PPRV were used to vaccinate sheep by intramuscular inoculation. Both recombinant adenovirus vaccines elicited PPRV-specific B- and T-cell responses. Thus, neutralizing antibodies were detected in sera from immunized sheep. In addition, we detected a significant antigen specific T-cell response in vaccinated sheep against two different PPRV strains, indicating that the vaccine induced heterologous T cell responses. Importantly, no clinical signs and undetectable virus shedding were observed after virulent PPRV challenge in vaccinated sheep. These vaccines also overcame the T cell immunosuppression induced by PPRV in control animals. The results indicate that these adenovirus constructs could be a promising alternative to current vaccine strategies for the development of PPRV DIVA vaccines.     

重组人硫氧还蛋白工程菌生物学特性稳定性的检测

[目的]观察和检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性.[方法]工程菌连续传代50代,通过对每10代进行质粒性状、蛋白表达水平、透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化检查,全面检测工程菌可能影响生产性能的生物学特性稳定性.[结果]各代工程菌提取的质粒经双酶切后均可见315 bp的目的基因片段;各代工程菌中Trx蛋白的表达量均为菌体总蛋白的20％左右;透射电镜观察呈现典型的大肠杆菌特性;革兰染色显示为阴性杆菌;各项生化检测结果与原始菌种无显著差异.[结论]该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种.     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

表达小反刍兽疫H蛋白的重组山羊痘病毒疫苗

本研究旨在构建表达小反刍兽疫H蛋白的重组山羊痘病毒,并评价其免疫效力。利用筛选基因gpt和eGFP并结合空斑技术,纯化筛选了重组小反刍兽疫H基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-H),经过PCR鉴定重组病毒已纯化。免疫荧光和蛋白印迹都表明重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞表达小反刍兽疫H蛋白。以2×106PFU的rGPV-PPRV-H皮内注射免疫山羊6只,并于首次免疫后28d以相同剂量进行二次免疫。免疫后采血分离血清进行病毒中和试验,结果表明,一次免疫后21d,山羊痘病毒中和抗体效价依次为40、80、≥80、≥80、40、≥80,和小反刍兽疫病毒中和抗体效价全部转阳依次为80、80、80、80、40、40、10;二次免疫后14d,山羊痘病毒中和抗体效价抗体全部大于或等于80,小反刍兽疫病毒中和抗体效价依次为≥80、80、≥80、80、80、40,应该具有对山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒强毒攻击的完全免疫保护作用。本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化提供了参考。     

水稻YTB中OSVDAC5蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆水稻YTB osvdac5基因,原核表达后获得纯化的OSVDAC5蛋白,制备相应的抗体.方法:采用Trizol法提取水稻总mRNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增得到该基因与原核表达载体连接,构建重组质粒pET-30a-osvdac5,并转入大肠杆菌进行原核表达,SDS-PAGE检测表达产物.通过镍柱纯化获得的单一目的蛋白用于抗体制备,用Western Blot检测抗体的特异性.结果:克隆到原核表达载体中osvdac5基因的ORF为813 bp,编码271个氨基酸.在大肠杆菌中15℃、0.7mmol/L的IPTG浓度诱导17 h是pET-30a-osvdac5融合蛋白表达的优选条件,表达的OSVDAC5蛋白属于包涵体蛋白.镍柱纯化后的OSVDAC5为30 kD左右的单一条带.Western Blot分析表明,抗体能够与30 kD处的OSVDAC5蛋白进行特异性结合.结论:成功克隆了水稻YTB osvdac5基因,原核表达蛋白OSVDAC5制备的多免隆抗体具有一定特异性,能与免疫抗原结合,这为进一步研究OSVDAC5蛋白在植物不同生长发育时期中的表达模式奠定了基础.     

沙门菌外膜蛋白D的原核表达及多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达沙门菌外膜蛋白(OMP)D,纯化后制备兔抗OMPD抗体。方法:用PCR方法从鼠伤寒沙门菌中扩增出ompD基因,并插入融合表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET28a(+)-ompD;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化;以表达的OMPD蛋白免疫家兔,制备抗OMPD的多克隆抗体并进行鉴定。结果:扩增了ompD基因,测序证实正确后亚克隆于表达载体pET-28a(+)中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量为40×103的目的蛋白并进行纯化;纯化的OMPD免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶10000以上,且具有良好的特异性。结论:构建ompD基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗OMPD抗体,效价及特异性均良好,为进一步制备肠黏膜高亲和力疫苗奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S2截短肽的原核表达及其线性B细胞表位区鉴定

【背景】由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV S蛋白可以诱导宿主产生中和抗体。【目的】原核表达PEDV CV777疫苗株S2截短肽(aa:961-1 382)并制备其多克隆抗体;鉴定表达的S2截短肽上的线性B细胞表位区。【方法】将经密码子优化的PEDV S2截短肽编码DNA (s2t)克隆至载体p ET-28a中并转化Escherichia coli BL21(DE3),利用IPTG诱导S2截短肽表达。以经SDS-PAGE切胶纯化的重组S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。在E. coli BL21中GST融合表达覆盖S2截短肽序列全长、彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S2截短肽兔血清为一抗,通过Westernblot(WB)筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S2截短肽上的线性B细胞表位区。【结果】重组PEDV S2截短肽的相对分子质量约为50 kD;诱导4 h表达量最高,且主要形成包涵体。WB结果显示,纯化的S2截短肽能被猪抗PEDV血清识别;以纯化的S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多抗血清,ELISA法检测抗体效价位于1:25 600-1:102 400之间。免疫组化和间接免疫荧光分析均表明,制备的多抗血清可以识别Vero细胞培养的PEDV DR13弱毒株。以制备的多抗血清通过WB从52个GST融合表达的16肽中鉴定到11个阳性反应性16肽。WB分析显示,得到的阳性反应性16肽都可以被猪抗PEDV血清识别。鉴定到的阳性16肽在S2截短肽上形成4个线性B细胞表位区(aa:969-984;1 065-1 096;1 225-1 280;1 361-1 382)。【结论】高效价抗PEDV S2截短肽多克隆抗体的制备和S2截短肽上线性B细胞抗原表位区的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立有效的PEDV检测方法奠定了基础。     

Self-Assembly and Release of Peste des Petits Ruminants Virus-Like Particles in an Insect Cell-Baculovirus System and Their Immunogenicity in Mice and Goats

Peste des petits ruminants (PPR) is an acute, febrile, viral disease of small ruminants that has a significant economic impact. For many viral diseases, vaccination with virus-like particles (VLPs) has shown considerable promise as a prophylactic approach; however, the processes of assembly and release of peste des petits ruminants virus (PPRV) VLPs are not well characterized, and their immunogenicity in the host is unknown. In this study, VLPs of PPRV were generated in a baculovirus system through simultaneous expression of PPRV matrix (M) protein and hemaglutin in (H) or fusion (F) protein. The released VLPs showed morphology similar to that of the native virus particles. Subcutaneous injection of these VLPs (PPRV-H, PPRV-F) into mice and goats elicited PPRV-specific IgG production, increased the levels of virus neutralizing antibodies, and promoted lymphocyte proliferation. Without adjuvants, the immune response induced by the PPRV-H VLPs was comparable to that obtained using equivalent amounts of PPRV vaccine. Thus, our results demonstrated that VLPs containing PPRV M protein and H or F protein are potential “differentiating infected from vaccinated animals” (DIVA) vaccine candidates for the surveillance and eradication of PPR.