α-环糊精葡萄糖基转移酶催化合成α-熊果苷

以对苯二酚和麦芽糊精为底物,通过α-环糊精葡萄糖基转移酶和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶法反应体系催化合成α-熊果苷。优化后的催化条件:以葡萄糖当量(DE)值为8%~10%的麦芽糊精作为供体底物,麦芽糊精60g/L,对苯二酚150 mmol/L,缓冲液p H 6.0,在40℃下反应24 h。在此反应条件下,α-熊果苷的产量为3.17 g/L,对苯二酚转化率为7.77%。通过萃取法对α-熊果苷进行了初步分离,再经高效液相色谱-电喷雾串联质谱技术进行了结构测定,确定产物为α-熊果苷。     

肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的酶学表征及在催化合成α-熊果苷中的应用

将来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,SPase)基因进行密码子优化后将其插入到pET-28a中构建表达载体pET-28a-spase,诱导大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-spase表达制得SPase粗酶液,将重组SPase纯化后进行酶学表征。结果表明,重组SPase的比酶活为213.98 U/mg,纯化倍数为1.47倍,酶活回收率达87.80%。该酶最适温度为45℃,最适pH为6.5,该酶对蔗糖的Km为128.8 mmol/L,Vmax为2.167μmol/(mL·min),kcat为39 237.86 min-1,利用重组SPase催化氢醌合成α-熊果苷,最优条件为:氢醌添加量为40 g/L,蔗糖/氢醌的摩尔比为5:1,重组SPase 250 U/mL。在25 mmol/L的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(pH 7.0)中,反应温度30℃,避光反应24 h后终止反应,再用500 U/mL的糖化酶40℃处理2.5 h。α-熊果苷产量达98 g/L,氢醌的转化率接近99%。综上所述,文中克隆并研究了重组SPase,并建立了其在α-熊果苷生产中的应用。     

重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成α-熊果苷

利用重组大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)/pET-SPase发酵生产蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)。收集的菌体经高压破碎后离心得到粗酶液,通过镍NTA亲和层析、超滤除盐后得到电泳纯的SPase,纯化后的SPase的比酶活是原来的2.1倍,酶活回收率达到82.7%。经SDS-PAGE电泳测定,重组SPase的分子量约为59 kDa。该酶在不高于37℃,pH 6.0~6.7的条件下比较稳定,最适催化温度与最适催化pH分别为37℃,pH 6.7,该酶对蔗糖的米氏常数(Km)为7.3 mmol/L,最大反应速率(Vmax)为0.2μmol/(min.mg)。此外文中还以蔗糖和氢醌为底物,利用重组SPase催化合成α-熊果苷。其最佳反应条件为:20%蔗糖,200 U/mL的酶液,1.6%氢醌,pH 6.0~6.5,25℃,反应21 h。α-熊果苷的摩尔产率为78.3%,α-熊果苷的产量为31 g/L。     

ATP合成菌株的构建及用于联合生产S-腺苷甲硫氨酸

为降低S-腺苷甲硫氨酸的生产成本,构建了同时表达腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶3种酶的重组大肠杆菌菌株用于ATP的合成,并对ATP的转化条件进行了优化,优化后的反应体系为:腺苷30 mmol/L,乙酰磷酸二锂盐135 mmol/L,硫酸镁5 mmol/L,硼砂50 mmol/L,菌体2 g/L(湿重),反应液初始pH7.5,反应温度为35℃,反应时间为3 h,反应转化率可以达到99%以上。按照上述反应体系进行5 L放大,反应结束后再投入65 mmol/L D,L-甲硫氨酸和50 g/L(湿重)表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌体,并补加15 mmol/L硫酸镁,转化18 h S-腺苷甲硫酸浓度能达到8.7 g/L,转化率达到72.5%。     

固定化啤酒酵母细胞催化有机硅酮不对称还原

研究了固定化啤酒酵母细胞催化三甲基硅乙酮不对称还原反应,系统探讨了振荡速度、底物浓度、固定化细胞浓度、pH值和反应温度对反应速度、产率和产物光学纯度的影响。结果表明,上述因素对固定化啤酒酵母细胞催化三甲基硅乙酮不对称还原反应均有较显著的影响。振荡速度以150r/min为宜,底物浓度和固定化细胞浓度分别为14mmol/L和0.15g/mL较佳,适宜的pH值为7.3,最佳反应温度为25℃～30℃。在该优化反应条件下,反应最大产率和产物的光学纯度分别高达84.9%和90.2%ee。     

酶法合成抗病毒药物阿糖腺苷

目的:为了开发一种生产阿糖腺苷的有效方法。方法:研究了以产气肠杆菌完整细胞为催化剂酶法合成阿糖腺苷,优化了菌体培养条件以及酶反应条件。结果:在培养基中添加0.5%葡萄糖,33℃下培养16h,既能得到较多菌体,又能使菌体的催化活性保持较高。酶反应在pH7.0、25mmol/L的磷酸钾缓冲液中进行,底物浓度为阿糖尿苷30mmol/L,腺嘌呤10mmol/L,加入10%湿菌体,在60℃下振荡反应48h,腺嘌呤转化率可达90%。结论:酶法合成阿糖腺苷可应用于大规模工业化生产。     

蔗糖磷酸化酶全细胞催化AA-2G的条件优化

目的:使用表达蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-spase,作为全细胞催化剂,合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)。通过反应条件的优化研究,提高AA-2G的收率。方法:分别考察菌体量、缓冲液pH、蔗糖浓度、维生素C浓度、反应时间和温度对AA-2G合成反应的影响,再组合上述最佳条件进行反应。AA-2G的产量使用高效液相色谱法进行定量。结果:最佳反应条件为:菌体量15 mg/mL,缓冲液pH 4.5,蔗糖浓度100 g/L,维生素C浓度175 g/L,反应时间20 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G产量达到了35.7 g/L。结论:以蔗糖为底物,使用SPase合成AA-2G的研究报道较少。本研究通过优化此方法的反应条件,让AA-2G的产量得到了大幅提高。同时本研究中成功地采用了大肠杆菌工程菌作为全细胞催化剂,这比传统的使用粗酶液的方法更省时省力,有良好的应用潜力。     

两种耐热磷酸化酶的构建及高效催化合成红景天苷

目的:使用表达耐热蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌重组工程菌E. coli BL21/pET-Spase和耐热纤维二糖磷酸化酶的大肠杆菌重组工程菌E. coli BL21/pET-Cpase,发酵培养后粗酶液作为催化剂,以价格低廉的蔗糖为原料合成红景天苷。方法:分别构建耐热蔗糖磷酸化酶和耐热纤维二糖磷酸化酶大肠杆菌重组菌,然后将重组菌、蔗糖、酪醇和磷酸混合,得到反应混合物,使反应混合物在45℃下转化,而产生红景天苷。结果:在耐热蔗糖磷酸化酶酶液1200 U/L、耐热纤维二糖磷酸化酶酶液500 U/L、蔗糖110 g/L、酪醇30 g/L和磷酸50 m M的浓度下,反应条件为pH 7.0、温度45℃、转速50转/分、反应时间32小时后,红景天苷浓度达到23.7 g/L。结论:本研究使用蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶联合催化的工艺,成功地高收率合成了红景天苷。同时,本研究构建的耐热磷酸化酶酶活高,处理简单,为拓展糖苷类似物的合成提供了一种新的方法。     

蔗糖磷酸化酶的分离纯化及其催化合成α-熊果苷的研究

考察了肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)G123厌氧发酵产蔗糖磷酸化酶下游的分离纯化工艺.收集的菌体经超声破碎得到粗酶液,通过硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析分离后获得了电泳纯的蔗糖磷酸化酶,酶活回收率为31.7%,酶的分子量约为55.7 kD,纯化后的蔗糖磷酸化酶比活为115.3 U/mg.该酶在中性及偏酸性(pH5.5-8.0)情况下,酶稳定性较好,较报道的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-1149的pH稳定范围宽.同时该酶在37℃保存2 h,酶活几乎没有下降.利用获得的纯酶以氢醌和蔗糖为底物催化合成α-熊果苷,在23 U/mL的酶反应体系中,60%蔗糖、5%氢醌、pH7.5,37℃,反应12 h,氢醌转化率达到16.3%,α-熊果苷的产量为20g/L.     

响应面法优化脯氨酸羟化酶转化反应工艺条件

通过优化脯氨酸羟化酶表达条件和转化反应条件,提高其转化反应效率。采用单因素法筛选脯氨酸羟化酶的最佳诱导温度、诱导剂浓度和转化反应条件,并采用响应面法预测影响转化反应各因素的最佳条件。结果显示,经过筛选和验证,蛋白表达最适诱导温度为28℃,IPTG浓度为0.2 mmol/L;转化反应最佳条件为:120 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(pH 6.6)、1.5% Nonidet P-40、200 mmol/L L-脯氨酸、200 mmol/L α-酮戊二酸,6 mmol/L L-抗坏血酸、6.0 mmol/L 硫酸亚铁,最适反应温度为27℃,振荡速率为152 r/min。在最佳条件下,转化反应进行48 h后产物反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率可达100%,为合成反式-4-羟基-L-脯氨酸奠定了坚实的实验基础。     

重组大肠杆菌全细胞催化合成莱鲍迪苷D

莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)是一种稀有具有高甜度的甜菊糖苷类化合物。本文实现了重组大肠杆菌全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)合成RD。以水稻c DNA为模板,扩增得到葡萄糖基转移酶基因eugt11,构建了重组菌株E.coli BL21(p ETDuet-eugt11),并成功表达了重组蛋白6His-EUGT11。通过Ni柱亲和层析纯化并在体外酶催化反应表征了其催化活性。将重组菌BL21(p ETDuet-eugt11)应用于催化合成RD研究。探讨了反应体系pH、温度、柠檬酸钠浓度、菌体密度、二价金属离子、二甲苯体积分数、UDPG添加浓度对反应效率的影响。单因素考察结果显示,在菌体密度0.16 g湿细胞/m L反应液,底物RA浓度为1.0 mmol/L,pH 8.0,60 mmol/L柠檬酸钠,1%二甲苯,0.1 mmol/L Zn Cl2,12.0 mmol/L UDPG,反应温度42℃,反应时间24 h的条件下,RD产量为123.6 mg/L(约0.1 mmol/L)。     

人参细胞生物合成熊果苷转化体系的建立

以人参(Panax ginseng C. A. Mey.)培养细胞为生物反应体系,利用外源氢醌为底物,对熊果苷的生物合成进行了研究.TLC鉴别表明,人参细胞可以将外源的氢醌转化为熊果苷;以熊果苷含量和氢醌的转化率为指标,对人参细胞生物合成熊果苷的基本条件(氢醌浓度、转化持续时间、细胞培养阶段)进行了探讨, 结果表明,MS固体培养基上培养32 d的人参细胞,在含有2 mmol·L-1氢醌的生物合成培养基中转化24 h后,合成的熊果苷含量占细胞干重的7.176%,氢醌转化率也达到79.15%.     

利用固定化啤酒酵母合成5'-核苷三磷酸

固定化啤酒酵母细胞由5’-核苷一磷酸(NMPs)合成5’-核苷三磷酸(NTPs)。在250mL摇瓶中加入20g固定化酵母细胞和20mL反应液(NMP 40mmol/L,葡萄糖150mmol/L,K2HPO4-KH2PO4缓冲液250 mmol/L,硫酸镁10mmol/L),pH 7.0,35℃,反应2.5h,NTP转化率达到80%。底物溶液添加NAD 后,该固定化酵母细胞可反复使用10次,NTP的转化率稳定维持在70%以上。     

双酶偶联转化富马酸制备β-丙氨酸的工艺的建立与优化

酶转化法是生产β-丙氨酸的重要途径,但单一酶法转化存在底物价格较高的问题。通过构建双酶催化体系制备β-丙氨酸,即将来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶(AspA)和来源于谷氨酸棒杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸。催化反应中AspA与PanD的最适加酶比例为1∶80,其中AspA的浓度为10μg/mL,转化温度为37℃,pH为7.0;浓度为100 mmol/L的富马酸可在8 h内被完全转化,转化率为100%,摩尔产率为90.9%,β-丙氨酸的产量为90 mmol/L,约为7 g/L;浓度为200 mmol/L的富马酸在反应8 h后,体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol/L,约合9.8 g/L,继续延长反应时间,转化率并没有明显提高。根据该研究提出的双酶偶联转化工艺可将价格低廉的富马酸一步转化为具有高附加值的β-丙氨酸。     

在非光合条件下外源蔗糖能促进蚕豆的气孔开放

蚕豆植株经暗饥饿处理40h后,取其下表皮,再用超声波“原位分离”下表皮上的保卫细胞对,然后在无菌、非光合条件下,用外源蔗糖处理蚕豆下表皮上的保卫细胞对,考察其对气孔开放的效应。结果发现,在1d的无菌培养过程中,蔗糖显著促进了气孔的开放。100mmol/L的蔗糖在10mmol/L的MES-NaOH/KOH(pH6.1)缓冲液中,开度分别增加2.0/2.6μm;在1μmol/L的气孔开放促进剂fusicoccin(FC)的存在下,100mmol/L的蔗糖在MES-NaOH/KOH(pH6.1)缓冲液中分别增加开度5.0/5.5μm。不同浓度（5～200mmol/L）的蔗糖处理结果表明气孔开度的增加与蔗糖浓度呈一定的正相关,浓度为100mmol/L的蔗糖处理表现出最大促进作用。同时还初步观察到,蔗糖可维持保卫细胞存活率和叶绿体的完整性。     

正交试验法确定测定意大利蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶反应的最佳条件

用正交试验法研究了酶浓度、底物浓度、反应体系的pH值、反应温度和反应时间5个因素对测定意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica Spinola头部乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响, 并从试验组合中选出最佳条件。蜜蜂AChE活性的测定采用Gorun(1978)改进的Ellman方法, 以碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)为底物, 5, 5' 二硫双硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂, 测定反应物在412 nm波长下的光密度值, 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量, 经计算得到蜜蜂头部AChE的比活力。对正交试验结果进行极差分析和方差分析, 结果表明各因素对实验结果影响的大小顺序为：温度＞pH值＞时间＞酶浓度＞底物浓度。并得出测定蜜蜂头部AChE活性的最佳条件是：酶终浓度0.2头/mL、底物终浓度0.8 mmol/L、pH值7.5、温度40℃及反应时间5 min。     

腾冲嗜热杆菌热稳定海藻糖磷酸化酶的基因表达与酶的分子生物学性质研究

分离克隆了腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)海藻糖磷酸化酶(TreP)的编码基因(treP), 该酶可催化以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成反应及其逆向的分解反应. 反向mRNA点杂交实验表明, 腾冲嗜热杆菌中treP基因在高盐胁迫条件下表达量增加, 而在海藻糖诱导条件下表达量降低. 将该基因导入不含TreP的大肠杆菌中进行诱导表达, SDS-PAGE表明, 异源表达的TreP分子量约为90 kD, 与预期值相同. 通过葡萄糖氧化酶法测定分解产物葡萄糖的产率表明: TreP催化海藻糖分解反应的最适温度是70℃, 最适pH值为7.0; 通过HPLC检测合成产物海藻糖的产率表明: TreP催化合成反应的最适温度为70℃, 最适pH值为6.0. 在最适反应条件下, 50 μg的TreP粗酶可催化25 mmol/L α-1-磷酸葡萄糖与葡萄糖在30 min合成11.6 mmol/L海藻糖; 而同量的酶在同样时间内仅能将250 mmol/L海藻糖分解生成1.5 mmol/L葡萄糖. 以上体内胁迫和诱导表达分析及体外酶学性质分析均证明该酶的主要功能是催化海藻糖的合成反应. 热稳定性实验表明, 该酶性质比较稳定, 在50℃下温育7 h还能保持77%以上的活性, 是一个有潜在工业用途的新的热稳定海藻糖合成酶.     

反胶束体系中脂肪酶催化合成生物柴油

本文采用了实验室自制的Candida sp.99-125脂肪酶, 研究了其在丁二酸二酯磺酸钠(AOT)反胶束体系中, 催化大豆色拉油合成生物柴油的新方法。考察了溶剂极性、AOT浓度、W0(水与表面活性剂质量比)、缓冲溶液pH值、温度等因素对脂肪酶催化合成生物柴油的影响。研究结果表明: AOT/异辛烷反胶束体系为Candida sp.99-125脂肪酶催化提供了较为合适的微环境, 在W0为11, 表面活性剂浓度为50 mmol/L, 温度为40℃, 缓冲液pH值为7的AOT/异辛烷反胶束体系中, 醇油摩尔比为3∶1, 摇床转速为180 r/min, 采用12h3次流加1 mol当量的甲醇, 单批最高酯转化率可以达到90%。     

烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤和SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析等步骤,对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化。结果表明:该酶被纯化了119.6倍,得率为28.49%,经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为49.6kDa,亚基分子量约为25kDa;该酶最适温度为50℃,最适反应pH为5.5;Mg2+、Ca2+、Mn2+等对该酶有激活作用,金属离子螯合剂EDTA对酶有抑制作用,加入Mg2+后抑制作用得到解除;在最适反应条件下,测得反应底物磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)的Km值分别为0.23mmol/L和0.56mmol/L。     

面包酵母催化不对称合成4-氯-(R)-3-羟基丁酸乙酯

以4 氯乙酰乙酸乙酯为原料,以面包酵母为手性生物催化剂,选择性合成光学活性4 氯 (R) 3 羟基丁酸乙酯。经IR、GC MS、1HNMR和旋光度测定,表明所得产品的结构与预期的结构一致。分别考察了面包酵母用量、葡萄糖浓度、底物投入量、pH值、反应时间以及反应温度等因素对产品比旋光度的影响。结果表明,4 氯乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的适宜条件为:面包酵母6 0 0g/L、葡萄糖2 0g/L、反应温度34℃、底物加量16mL/L、反应时间4 8h、pH为5 ,产品的比旋光度为[α]2 0D = 13 9°。