重组大肠杆菌转化富马酸生产L-丙氨酸

通过克隆来源于睾丸酮丛毛单胞菌的L-天冬氨酸-β-脱羧酶基因,在一株具有L-天冬氨酸酶生产能力的大肠埃希氏菌CICC 11022S中异源表达,构建转化富马酸生产L-丙氨酸的重组工程菌。结果发现:重组工程菌9 h转化富马酸产生112.7 g/L的L-丙氨酸,生产速率12.5 g/(L·h),转化率93.8%。富马酸价格较低,有效降低L-丙氨酸生产的原料成本。通过构建重组工程菌,以富马酸为底物,高效生产L-丙氨酸,结果表明该方法具有较好的工业应用潜力。     

一菌双酶法制备L-4-氟苯丙氨酸

利用重组E．coli产天冬氨酸酶和天冬氨酸转氨酶催化生产L-4-氧苯丙氨酸的工艺。实验结果表明最佳转化条件为-37℃,pH值4．5—8．5,菌体与酮酸的质量浓度比为1.5,CTAB的质量分数为0．04％,酮酸的质量浓度11．28g／L,富马酸铵与酮酸的摩尔比为3．0：1．0,添加1mmol／L的Fe^2＋,L-天冬氨酸与酮酸的摩尔比为0．4：1。在最适条件下,经过14h酶转化反应达到平衡,酮酸转化率可达到95％以上,L-4-氟苯丙氨酸得率也可达到80％以上。此法原料简单易得,为L-4-氟苯丙氨酸的制备提供了一种新方法：     

L-天冬氨酸-α-脱羧酶高产菌株初筛方法的建立

通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)高产菌株的初筛方法进行研究。分别检测转化体系中底物L-天冬氨酸减少引起的pH变化及产物CO2和β-丙氨酸的增加量,并用高效液相色谱法比较这四种方法的准确性。结果表明:CO2能溶于转化液,难以用倒置管收集完全;PanD系胞内酶,难以用平板点种法改变平板的pH;β-丙氨酸和L-天冬氨酸在Berthelot检测中吸收值均偏低,不适用于PanD高产菌的筛选;纸层析法可以直接检测β-丙氨酸和L-天冬氨酸,成本低,操作简单,具一定的精确度,可以较大规模地筛选PanD高产菌株。     

谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸

【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3), 对重组菌进行诱导表达, 表达产物经DEAE离子交换层析和G-75 分子筛层析纯化后进行酶学性质研究, 然后进行酶转化实验, 说明底物和产物对酶转化的影响。【结果】重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50%以上, AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL。该重组酶最适反应温度为55 °C, 在低于37 °C时保持较好的稳定性, 最适pH为6.0, 在pH 4.0?7.0范围内有较好的稳定性。酶转化实验说明: 底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用; 实验建立了较优的酶转化反应方式, 在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时, 以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式, 使100 g/L底物转化率达到97.8%。【结论】重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达, 研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素, 为其工业应用奠定了基础。     

双酶偶联转化果糖制备含有稀少糖的混合糖液

酶转化法是功能性稀少糖生产的重要途径,但单一稀少糖转化酶的转化率普遍较低。文中提出构建双酶偶联转化系统提高转化效率的思路,即利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)和L-鼠李糖异构酶(L-rhamnose isomerase,L-RhI)双酶偶联反应,催化D-果糖生成D-阿洛酮糖和D-阿洛糖等功能性稀少糖。DPE和L-RhI加酶量的比例为1∶10,其中DPE的浓度为0.05 mg/mL;转化反应的最佳温度为60℃,最适pH为9.0。当D-果糖浓度为2%时,反应10 h达到平衡,此时D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的产量分别为5.12和2.04 g/L。利用文中提出的双酶偶联系统可以将果葡糖浆等富含果糖的低附加值原料转化为含有功能性稀少糖的高附加值混合糖液。     

化学-酶法制备L-高苯丙氨酸

以苯丙酸乙酯为原料,通过正交设计优化2-氧4-苯基丁酸盐的制备条件：苯丙酸乙酯与草酸二乙酯摩尔比为1：3,缩合反应时间为2．5h,H2SO4质量分数为20％,水解反应时间为15h,优化条件下2-氧-4-苯基丁酸盐的产率为68．24％。随后,利用E．coli A5所产的天冬氨酸转氨酶为生物催化剂制备L-高笨丙氨酸。酶转化反应的最适条件为：游离细胞体系pH、温度、底物质量浓度和细胞质量浓度分别为8．5、37℃、20g/L和30g／L;而固定化细胞体系则分别为7．0—9．0、40℃、10g／L和30g/L。采用廉价的L-谷氨酸（L—Glu）作为氨基供体,添加表面活性剂有利于提高L-HPA产率。通过研究固定化细胞转化反应进程,结果发现8h内90％的底物可转化为L—HPA。     

来源于西梅的(R)-醇腈酶促立体选择性转氰合成(R)-酮醇腈

在水/有机溶剂双相反应体系中,研究了来源于西梅的(R)-醇腈酶催化酮与丙酮醇腈合成(R)-酮醇腈的立体选择性转氰反应．系统探讨了不同酶源、酶粉颗粒大小、底物浓度、两底物配比、酶浓度和底物结构对转氰反应的影响．结果发现西梅醇腈酶能高效催化三甲基硅酮与丙酮醇腈的立体选择性转氰．酶粉颗粒大小以直径0.3～0.45 mm为优,底物浓度以21 mmol/L左右为佳,底物丙酮醇腈与三甲基硅酮摩尔浓度比以2∶1为宜,酶浓度以60.9 g/L左右为好．西梅醇腈酶对3, 3-二甲基-2-丁酮几乎没有催化活性,而对其硅结构类似物三甲基硅酮却具有非常高的立体选择性和催化活性,在上述优化反应条件下反应24 h的底物转化率和产物光学纯度均高达99%以上,表明底物中的硅原子对西梅醇腈酶的催化活性有非常显著的促进作用．     

β-脱卤酶的基因克隆表达及其酶学性质

根据GenBank中的序列设计引物,克隆芽孢杆菌中的β-脱卤酶基因(命名为bhd)。以pET30a(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)-CondonPlus为宿主菌,实现了bhd的高效表达。使用HisTrapTMFF亲和层析柱纯化重组β-脱卤酶,分子量约为23.1 kD。酶学性质研究表明,纯化的重组β-脱卤酶水解3-氯丙酸制备3-羟基丙酸的最适反应体系为30°C,100 mmol/L,pH 7.0的磷酸钠缓冲液。在最适反应条件下,重组β-脱卤酶的比活为16.2 U/mg,Km和Vmax分别为3.26μmol/L和17.86 mmol/(min.g protein)。在最适反应条件下,以10 mmol/L 3-氯丙酸为底物,反应36 h的转化率在93%以上。     

固定化天冬氨酸酶制备(R)-3-氨基丁酸

从芽孢杆菌Bacillus sp.YM55-1基因组中克隆得到天冬氨酸酶基因,以pET-28a(+)为载体构建天冬氨酸酶基因的表达载体pET-28a(+)-Asp,将天冬氨酸酶基因进行定点突变,在E.coli BL21(DE3)系统中实现了天冬氨酸酶的异源表达。利用重组的天冬氨酸酶,以氨水、(NH_4)_2SO_4为辅料,将底物巴豆酸转化为(R)-3-氨基丁酸。将天冬氨酸酶的工程菌制备成固定化细胞,通过反应条件的优化研究,提高底物的转化率。结果表明:天冬氨酸酶最适pH为9.0,最适反应温度为40℃。在此反应条件下,加入30 g/L固定化细胞,转化22 h,(R)-3-氨基丁酸质量浓度达到220 g/L,对映体过量值e.e._s≥99.95%,底物转化率达到98%,固定化细胞重复使用次数不低于24次。     

重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

将来自于Bacillus circulans 251的β-CGTase编码基因克隆到表达载体pET-20b(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)。经酶活检测培养基上清中的β-CGTase酶活为20 U/mL。对酶转化淀粉生成β-环糊精的反应条件进行了优化,结果表明,当底物马铃薯淀粉浓度15%,反应初始pH5.5,温度30℃,加酶量10 U/g干淀粉,环己烷浓度2.5%-5%(V/V),转化周期24 h,β-环糊精转化率达到最高值75.3%,是国内外报道的酶法生产β-环糊精的最高水平。     

枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸a脱羧酶的酶学性质

b-丙氨酸是一种重要的医药化工原料,目前主要依靠化学法进行生产。探寻更为环保和高效的生物生产法是未来研究的一个方向。L-天冬氨酸a脱羧酶 (PanD) 能特异地脱去L-天冬氨酸的a羧基,生成b-丙氨酸。本文比较了3种分别来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及枯草芽胞杆菌的PanD比酶活 (分别为0.98、7.52和8.4 U/mg)。后两者的最适pH均为6.5,最适反应温度分别为65 ℃及60 ℃。与目前研究最多的来源于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的PanD相比,来源于枯草芽胞杆菌的PanD具有更好的活性和热稳定性,具有更强的工业应用潜力。同时,本文对该酶特有的翻译后自剪切及机理性失活现象进行了分析和讨论。     

α-氨基酸酯酰基转移酶表达纯化、酶学性质及其催化应用

α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase,AET)能够催化底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)。利用重组大肠杆菌saet-QC01表达α-氨基酸酯酰基转移酶,对其表达条件进行了优化,通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组蛋白,并对其酶学性质、催化应用进行了研究。适合酶表达的诱导条件:温度20℃,诱导阶段(OD_(600)=2.0-2.5),IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间12 h。α-氨基酸酯酰基转移酶的最适反应温度27℃,最适pH 8.5,在pH 7.0-8.0很稳定,在酸性条件下相对稳定,低浓度的Co~(2+)、低浓度的EDTA对酶活有促进作用。在底物浓度丙氨酸甲酯盐酸盐600 mmol/L、谷氨酰胺480 mmol/L,丙谷二肽的产量达到78.2 g/L,生产速率达到1.955 g/(L·min),转化率达到75.0%。α-氨基酸酯酰基转移酶具有良好的酸碱耐受性,催化效率高的优良特性,在工业生产中具有较好的应用潜力。     

静息细胞转化生产3-羟基丙酸的条件优化

本文研究了静息细胞生物转化生产3-羟基丙酸的反应体系。考察了以甘油为底物,利用静息细胞转化生产3一羟基丙酸的相关因素,确定了最佳的转化条件：细胞浓度20g／L,甘油浓度20g／L,辅酶VB12浓度10mg／L,NAD＋浓度0．15mmol／L,温度35℃,反应体系为0．05mol／LpH7．0Tris—HCl缓冲液。在上述条件下反应6h后,3-羟基丙酸的产量达到为3．17g／L,底物转化率为28．33％。由上述结果可知,采用静息细胞转化法为3-HP的生物合成提供了一种可能的方法。     

两种L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达与酶学性质分析

【目的】实现单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)L-天冬氨酸α-脱羧酶基因在Escherichia coli中异源表达,纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。【方法】依照E.coli的密码子偏好性优化来源于L.monocytotogens和C.jeikeium的pan D基因序列。人工合成后以此构建表达载体pET28a(+)-pan D_(Lm)和p ET28a(+)-pan D_(Cj),转化E.coli BL21(DE3),实现panD_(Lm)和panD_(Cj)基因的异源表达。利用亲和层析纯化获得携带组氨酸标签的纯酶后进行酶学性质研究,并考察底物对酶反应的影响。【结果】重组菌蛋白电泳分析结果表明,重组酶panD_(Lm)和panD_(Cj)均有自加工功能,裂解后形成了α亚基和β亚基。重组酶比酶活分别为8.9 U/mg和11.8 U/mg。两种酶的最适反应温度均为60°C,最适p H分别为7.0和6.0,它们都在30-50°C,酸性条件下较稳定。与目前研究最多的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的Pan DC.g相比,Pan DL.m受底物天冬氨酸的抑制作用较小。【结论】panD_(Lm)和panD_(Cj)可在高温酸性条件下特异性转化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,其中panD_(Lm)受底物的抑制作用较小,具有一定的工业应用潜力。     

重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的工艺条件优化

摘要：【目的】β-葡萄糖苷酶可用于酶法生产龙胆低聚糖。为了给龙胆低聚糖的生产提供大 量的酶来源,构建基因工程菌表达黑曲霉(CMI CC 324626)β-葡萄糖苷酶基因（bgl）并研究重组酶生产龙胆低聚糖的工艺条件。【方法】将bgl克隆到表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71。表达产物通过HPLC和LC-MS鉴定了其可用于生产龙胆低聚糖的转苷活性,并对酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖的反应条件进行了优化。【结果】实现了β-葡萄糖苷酶的过量表达。当底物葡萄糖浓度为80%,反应pH4.5,温度为60℃,加酶量为每克葡萄糖60 U,添加1 mmol/L的K+,转化周期为48 h,龙胆低聚糖累计达到最大为50 g/L。【结论】本研究是国内外首次利用重组酶酶法生产龙胆低聚糖的报道。     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究

目的:利用海藻酸钠和壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶,催化合成红景天甙,并对固定化条件的选择、固定化酶催化合成红景天甙的条件优化进行研究.方法:采用正交实验方法寻求最佳固定化条件,以转化率为指标对合成条件进行优化.结果:固定β-葡萄糖苷酶的最佳条件为:壳聚糖浓度1.5%,吸附时间9h,交联时间12h,戊二醛浓度1.0%,吸附温度O℃,酶活力回收率达74.38%.催化合成红景天甙的最佳条件为:反应介质pH 5.8醋酸缓冲液/叔丁醇(1:9),底物浓度酩醇5g/L,D-葡萄糖与酪醇摩尔比为1:1,反应时间50h,反应温度50℃,红景天甙的转化率最高可达到71.9%.结论:固定化酶催化合成红景天甙的转化率得到较大的提高,为工业化生产提供了可靠的理论依据.     

产L-天冬氨酸α-脱羧酶细菌的分离、鉴定及发酵条件优化

【目的】从葡萄园土壤中分离L-天冬氨酸α-脱羧酶的产生菌株,对其进行分类鉴定,优化其产生L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵条件,为β-丙氨酸的生物合成提供基础。【方法】采用变色圈法和液体复筛培养基分离筛选具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活力的菌株,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S r RNA序列同源性分析鉴定菌株的系统发育学地位,采用单因素及正交设计试验优化培养基及发酵条件。【结果】筛选到一株L-天冬氨酸α-脱羧酶高产菌株Pan D37,其亲缘关系和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)较近,且形态与培养特征、生理生化特性与特基拉芽孢杆菌基本相符。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:蔗糖22.5 g/L、富马酸7.5 g/L、蛋白胨20 g/L、L-天冬氨酸6 g/L、Triton X-100 2g/L,起始p H为7.0,装液量50 m L/500 m L,摇床转速220 r/min,种子液接种量为5%(V/V),35°C培养28h。在最优条件下L-天冬氨酸α-脱羧酶活力可达44.57 U/m L,比初筛时提高2.57倍。【结论】分离并获得一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37,经条件优化后具有较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶产生能力,有望应用于β-丙氨酸的工业生产。     

高产天冬氨酸酶的大肠杆菌细胞的固定化

用聚乙烯醇凝胶包埋具有高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌(Escherichia coli)No.1细胞。该酶的表现活力高达1638 00u／g湿细胞,酶活力的回收率为97．5％。固定化细胞和游离细胞天冬氨酸酶的最适pH均为8．0,最适温度分别为40—45℃和40—55℃。二价金属离子Mn2+、Mg2+、Ca2+和Fe2+对热钝化的天冬氨酸酶活力具有保护作用。在37—45℃下,两种细胞的热稳定性相同。二者在pH6．0的柠檬酸缓冲液中比较稳定。固定化细胞在1mol／L、pH8．0的底物溶液(内含Mn2+1mmol／L)中于4℃冰箱保存6个月,天冬氨酸酶的活力保持不变。用固定化细胞柱连续生产L-天冬氨酸,底物转化为产物的转化率达95％以上;产物的总 收率为91．1％。固定化细胞柱连续运转40天,天冬氨酸酶活力仍保持最初酶活力的90％。     

谷氨酸氧化酶高产菌株的筛选鉴定及催化生产α-酮戊二酸

采用简易的偶联终点显色反应(Trinder显色反应),从土壤中分离出高产谷氨酸氧化酶(LGOX)的菌株不透明红球菌Rhodococcus opacus FMME1-41,并对此菌株的产酶特性进行研究。结果表明:该菌株所产LGOX主要分泌在发酵液中,对L-谷氨酸具有较强的底物专一性,最适pH 6.5,最适温度为35℃,Mn~(2+)是该酶的激活剂。通过发酵培养基优化,培养30 h时LGOX活力达到6.4 U/m L。利用该酶转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸,在最佳转化条件下转化20 h,α-酮戊二酸产量达到91.2 g/L,转化率为91.8%,α-KG生产强度为4.56 g/(L·h)。