酵母双杂交筛选心脏cDNA文库中与人热激蛋白70相互作用的蛋白质

目的:利用酵母双杂交系统从人心肌cDNA文库中筛选与热激蛋白70(HSP70)相互作用的蛋白质。方法:从人心脏cDNA文库扩增Hsp70基因,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-Hsp70酵母细胞AH109中的自激活活性;将构建的酵母表达诱饵质粒载体pGBKT7-Hsp70转化AH109酵母细胞,与转化有人心脏cDNA文库的酵母Yl87进行交配实验,筛选与HSP70相互作用的蛋白质,通过一对一的回复杂交实验排除假阳性,对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:构建了"诱饵"质粒栽体pGBKT7-Hsp70,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活活性,筛选得到多个与Hsp70相互作用的阳性转化子,并最终得到HSP70的1个相互作用蛋白质HIP。结论:应用酵母双杂交系统筛选出与HSP70相互作用的1个蛋白质,它们的相互作用可能与HSP70发挥细胞分子伴侣作用有关。     

人DNAJB6蛋白与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的鉴定

pUL23是人巨细胞病毒（HCMV）UL23基因编码的皮层蛋白. HCMV皮层蛋白与病毒颗粒的形成、病毒转移、免疫调控等病毒生活过程相关.利用GAL4 酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,获得与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白分子DNAJB6 ［DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6］.回复酵母双杂交、体外GST-Pull down和免疫共沉淀试验再次确认两者之间的相互作用.该结果为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

Bax Inhibitor-1与Herp的相互作用

应用酵母双杂交技术筛选Herp的相互作用蛋白。构建编码Herp的基因HERPUD1真核表达载体HERPUD1plexA,应用MATCHMAKERLexA酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库,获得的阳性克隆的插入子为Herp的候选相互作用蛋白质,将Herp与筛选到的相互作用蛋白再一对一回复进行酵母双杂交实验,去除假阳性。对阳性克隆插入子的DNA序列测序,在GenBank中作匹配及生物信息学分析。结果得到其中1个阳性克隆的插入子序列与TEGT基因序列一致,编码蛋白为Baxinhibitor1。得出结论:Herp与Baxinhibitor1相互作用,Baxinhibitor1具有调节凋亡特性,提示Herp可能参与凋亡调节。     

酵母双杂交筛选类固醇激素合成急性调节蛋白的相互作用蛋白质

目的:利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)相互作用的蛋白质。方法:将全长STAR基因克隆到酵母表达载体pDBLeu中,形成诱饵;将构建好的诱饵质粒转化至AH109酵母感受态中,利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,并进行相互作用的回转验证。结果:构建了酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-STAR,并筛选到6个猎物,其中有5对相互作用回转验证阳性。结论:为进一步研究STAR的功能和作用机制提供了新的线索。     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1（1）,pDBLeu-GATA1（2）,pDBLeu-GATA1（3）,筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B相互作用的蛋白质

应用酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B（hPRB）发生相互作用的蛋白质,有助于进一步阐明其在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用的调控机制。应用酵母双杂交系统3,以hPRB不同结构域为诱饵,筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,并运用X—α—Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。最终以AF1-DBD结构域作为诱饵最终筛出了1个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这个克隆所编码的蛋白为PIAS3（活化的STAT3的蛋白抑制剂）。结果表明,孕激素受体可以和PIAS3发生相互作用,它们的相互作用有可能参与乳腺癌的生长调控。     

利用酵母双杂交系统从人胚胎肝脏cDNA文库中筛选与JNKK2相互作用的蛋白

目的:利用酵母双杂交系统,以149位赖氨酸突变成甲硫氨酸的c-Jun N端激酶激酶2(JNKK2)失活突变体(JNKK2KM)为诱饵,从人胎肝文库中筛选能与JNKK2作用的蛋白。方法:构建诱饵质粒p GBKT7-JNKK2KM,将其转化到AH109感受态酵母菌中进行扩增,而后检测融合蛋白表达、自激活活性以及对宿主的毒性;将诱饵酵母菌与含有人胎肝c DNA文库质粒的Y187交配进行酵母双杂交筛选,经缺陷型培养基筛选排除假阳性克隆;取阳性菌落抽提质粒进行酶切鉴定,对鉴定后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,明确筛选出的蛋白信息,通过免疫共沉淀实验验证筛选出的蛋白与JNKK2的相互作用。结果:构建了诱饵质粒,检测到融合蛋白的表达,且无自激活作用,未发现对宿主存在毒性;初步筛选到120个阳性克隆,经多轮重复验证得到阳性克隆11个,经生物信息学分析最后确定3个可以与JNKK2相互作用的新蛋白质分子为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β多肽2样蛋白1(GNB2L1)、开放读框60(ORF60)与泛素样修饰物激活酶3(UBA3),免疫共沉淀实验表明它们均能与JNKK2发生相互作用。结论:筛选到3个新的JNKK2相互作用蛋白,为深入探究JNKK2在肝脏中的作用奠定了基础。     

利用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的病毒编码蛋白

人巨细胞病毒(HCMV) UL23基因编码病毒皮层蛋白,该基因缺失时,病毒在人包皮成纤维细胞(HFF)中的繁殖速度加快.为进一步阐述HCMV UL23基因编码产物 pUL23的功能及调控机制,采用鸟枪法构建了融合于GAL4活性区域的HCMV Towne株 基因组随机表达文库.利用酵母双杂交技术,以pGBKT7 -UL23为诱饵质粒,从构建 的HCMV基因组表达文库中筛选到与pUL23相互作用的病毒编码蛋白pUL24. GST-pull down实验和免疫共沉淀实验进一步确认两种病毒蛋白之间的相互作用.结果 表明,构建的HCMV基因组表达文库能够用于GAL4酵母双杂交系统筛选与诱饵蛋白相互作用的病毒自身编码蛋白.病毒蛋白pUL23和pUL24之间具有相互作用,这为进一 步阐述pUL23在HCMV感染过程中的功能提供依据.该研究为揭示HCMV病毒感染机制奠定了基础.     

应用酵母双杂交技术筛选与埃博拉病毒VP24、VP35、VP40蛋白相互作用的宿主蛋白

目的:用酵母双杂交实验筛选人肝cDNA文库,得到与埃博拉病毒VP24、VP35、VP40蛋白相互作用的蛋白质,用以研究VP24、VP35、VP40蛋白的生物学功能。方法:以埃博拉病毒VP24、VP35、VP40为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术对人肝cDNA文库进行初步筛选,并采用DNA测序技术及生物信息学技术进行分析。结果:筛选到13个可能与VP24、VP35、VP40相互作用的蛋白,包括视黄酸受体应答蛋白2(RARRES2)、PRKA激酶相互作用蛋白1(AKIP1)、白蛋白(ALB)、补体因子1(CF1)、人肿瘤易感基因(TSG101)等。结论:应用酵母双杂交技术初步筛选出与埃博拉病毒VP24、VP35、VP40相互作用的宿主蛋白,并完成了初步功能分析。     

酵母双杂交系统筛选与组蛋白去乙酰化酶1相互作用的蛋白质

目的：获得组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）的cDNA并构建为酵母双杂交系统中的饵基因,筛选出与其相互作用的蛋白质。方法：利用RT-PCR方法从人HeLa细胞中克隆出1446bp的cDNA片段,重组入载体pGBKT7得到pGBKT7-HDAC1,转化至酵母菌AH109,检测其对酵母细胞无毒性也无自激活报告基因活性,然后将其与已转入HeLa细胞基因组cDNA文库的酵母菌融合,进行筛选和验证工作。结果：筛选出3个阳性克隆,经免疫共沉淀试验进一步验证,发现仅有1个蛋白能与HDAC1发生相互作用,测序结果表明该蛋白为FHL2。结论：应用酵母双杂交方法筛选出HDAC1的相互作用蛋白FHL2,为进一步研究HDAC1的作用提供了新线索。     

酵母双杂交筛选锥虫早老素蛋白相互作用蛋白

目的筛选寻找锥虫早老素蛋白相互作用蛋白,以了解锥虫早老素蛋白功能。方法体外表达锥虫早老素蛋白片段,装入pGBKT7诱饵质粒,与随机肽库系统共转化酵母,筛选阳性克隆并测序,通过与基因库锥虫功能序列比较,推导可能的相互作用蛋白。结果获得108个阳性克隆,对其中50个进行了序列测定和比较,获得最有可能的4个候选基因,分别为：丝/苏氨酸性磷酸酶2b催化亚基A2;钙激活蛋白,含锚蛋白重复序列蛋白以及一个具有与APP跨膜区结合位点特征序列的功能未知蛋白。结论成功利用随机肽库酵母双杂交系统筛选锥虫早老素蛋白相互作用基因,其相互作用仍有待进一步确认。     

3种市售免疫调节剂作为流感病毒融合蛋白NM2e亚单位疫苗佐剂的研究

目的:观察具有免疫调节作用的市售左旋咪唑、西米替丁、伐地那非作为甲型流感病毒核蛋白(NP)与基质蛋白2胞外区多肽(M2e)融合蛋白NM2e亚单位疫苗佐剂的可能性。方法:将左旋咪唑、西米替丁、伐地那非单独或者分别与Al(OH)3配伍作为NM2e蛋白佐剂,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过体液和细胞免疫检测及病毒攻击实验研究这些免疫调节剂作为疫苗佐剂的可能性。结果:左旋咪唑对NM2e蛋白亚单位疫苗无明显的佐剂效应,但与铝佐剂合用可使攻毒后存活小鼠体重恢复加快;西米替丁可以明显提高NM2e蛋白诱发的特异性IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(30%),但保护效果明显低于铝佐剂(70%),与铝佐剂无明显的协同作用;伐地那非能明显增加NM2e蛋白诱发的特异性IgG1、IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(36%),但与铝佐剂合用有相互抑制作用。结论:左旋咪唑、西米替丁、伐地那非对NM2e蛋白均有一定的免疫调节作用,其中西米替丁和伐地那非能提高攻毒保护效果,但保护效果明显低于Al(OH)3,与Al(OH)3联合使用均无协同作用。     

用MLVA技术和多重PCR对犬种布氏菌基因分型

目的：对犬种布氏菌的遗传关系进行不同分子分型方法的对比研究,为犬布病分子流行病溯源提供有效方法。方法：采用多重PCR和多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）方法对24株犬种布氏菌的遗传关系进行比较研究。结果：多重PCR只鉴定出1株犬种布氏菌,其余23株均鉴定为猪种鲁氏菌,但不能鉴定型别;MLVA方法对已鉴定为猪种的布氏菌仍可再细分为型,87%（20/23）为猪3型,13%（3/20）为猪1型。结论：MLVA可以对布氏菌种（生物型）进行基因分型鉴定,可以作为传统表型鉴定方法的补充。     

白血病相关蛋白16与角蛋白18相互作用的鉴定

目的：验证白血病相关蛋白（LRP）16与角蛋白（KRT）家族成员KRT18之间的相互作用关系。方法：PCR扩增KRT18及其结构域缺失体基因片段,构建KRT18全长及其结构域真核表达载体,通过体外GST pull down实验和体内免疫共沉淀实验验证LRP16/KRT18的相互作用,并鉴定其作用的结构域。结果：构建了KRT18及其结构域重组子,GST pull down实验证明LRP16与KRT18在体外存在相互作用,它们的特异结合区域位于KRT18的C端,KRT18能够与LRP16的C端结构域相互作用;免疫共沉淀实验表明内源性LRP16与KRT18的C端在体内存在特异结合。结论：KRT18与LRP16存在相互作用,为进一步研究KRT18影响LRP16的亚细胞分布及调控LRP16核功能执行的作用机制奠定了基础。     

ORP8与SPAG5相互作用并影响细胞周期

目的：筛选与氧化固醇结合蛋白相关蛋白8（Oyxterol binding protein related protein 8,ORP8）相互作用的蛋白质,为揭示ORP8在细胞中的功能及其机制提供线索,并根据相互作用蛋白质初步探索ORP8的功能。方法：构建重组诱饵质粒pGBKT7-ORP8m,利用GAL4酵母双杂交系统筛选人Universal cDNA文库,筛选出与ORP8相互作用的蛋白质,通过GSTPull-down以及免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）验证蛋白质相互作用,并通过流式细胞仪检测过表达ORP8对HepG2细胞周期的影响。结果：酵母双杂交筛选得到了精子相关抗原5（Homo sapiens sperm associated antigen 5,SPAG5）,体外GSTpull-down和Co-IP实验确证了ORP8-SPAG5的相互作用,流式细胞术显示ORP8过表达后与空载体相比,人肝癌细胞系HepG2的S期细胞数增加,G1期细胞数减少。结论：SPAG5是与ORP8相互作用的蛋白质,ORP8过表达影响人肝癌细胞系HepG2的细胞周期,可能通过SPAG5起作用。ORP8-SPAG5的相互作用为进一步研究ORP8在肝细胞中的功能及其机制提供了有用的线索     

不同萃取体系对小球藻藻渣成分的影响

考察5种萃取体系（A：正己烷,B：正己烷/乙醇,C：正己烷/异丙醇,D：氯仿/甲醇,E：氯仿/乙醇）对小球藻（Chlorella phyrenoidosa）油脂的提取效果及藻渣成分的影响。实验结果表明：不同的萃取体系下,油脂得率为D（12.27%）、E（8.87%）、C（7.71%）、B（6.80%）、A（3.91%）,藻渣蛋白含量为A（52.60%）、E（46.23%）、B（40.19%）、C（39.52%）、D（32.52%）,藻渣碳水化合物含量为A（23.28%）、E（16.15%）、B（13.24%）、D（13.50%）、C（9.06%）;藻渣色素含量为A（1.75%）、E（1.29%）、B（1.14%）、C（0.96%）、D（0.58%）;藻渣灰分含量为D（3.63%）、E（2.94%）、C（2.23%）、B（2.25%）、A（1.48%）。综合考虑微藻生物柴油的生产及藻渣的可利用性,V（氯仿）/V（乙醇）=1是一种油脂萃取效果较好,藻渣营养成分损失较小的小球藻油脂萃取体系。     

慢性低O2高CO2对大鼠海马神经细胞TLR4和NFκB的影响

目的：探讨慢性低O2高CO2对大鼠海马神经细胞TLR4和NFκB的影响及作用。方法：采用慢性低O2高CO2肺动脉高压大鼠模型,30只大鼠随机分为正常对照组（NC）、低O2高CO2 2周组（2HH组）和低O2高CO2 4周组（4HH组）,免疫组织化学法检测海马CA1／3区细胞TLR4和NFκB的表达,TUNEL法检测海马细胞凋亡。结果：模型组大鼠海马CA1／3区TLR4蛋白的表达随着时间延长而显著,2HH组（CA1：0．1275±0．0242,CA3：0．1156±0．0376）,4HH组（CA1：0．1522±0．0187,CA3：0．1427±0．0453）,与NC组比较有显著性差异（P〈0．05,P〈0．01）。NC组大鼠海马CA1／3区可见NFκB／p65少量表达于胞浆,而模型组可见NFκB／p65在细胞核内不同程度表达,2HH组（CA1：0．1326±0．0324,CA3：0．1301±0．0112）,4HH组（CA1：0．1612±0．0428,CA3：0．1578±0．0365）,与NC组比较分别有显著性差异（P〈0．05,P〈0．01）。模型组大鼠海马CA1／3区细胞凋亡明显增多,与NC组比较分别有显著性差异（P〈0．01）,以4HH组为著。结论：TLR4和NFκB激活可能在慢性低O2高CO2大鼠海马神经细胞凋亡中有重要作用。     

免疫共沉淀联合质谱对肝细胞核因子3β蛋白复合体的分离鉴定

目的:利用免疫共沉淀联合质谱分析方法,在人肝癌细胞系细胞株HepG2内筛选与肝细胞核因子(HNF)3β相互作用的蛋白质。方法:通过免疫共沉淀,用特异抗体分离出HNF3β蛋白复合体,质谱鉴定其成分,NCBI数据库检索各个蛋白质的功能,分析筛选与HNF3β相互作用的蛋白质。结果:利用免疫共沉淀联合质谱分析筛选到32个与HNF3β相互作用的候选蛋白质,数据库检索发现LMNA与HNF3β具有相同功能注释,参与转录调控。结论:在细胞内HNF3β与多种蛋白质有相互作用,协同参与转录调控,推测HNF3β/LMNA之间相互作用的变化与葡萄糖及脂肪代谢及相关疾病的发生有关。