Tau融合蛋白及其缺失突变体与朊蛋白的体外作用分析

在部分朊病毒病（prion diseases）中,高度磷酸化的微管相关蛋白tau与朊蛋白(prion protein,PrP)发生共定位,tau蛋白可能在朊病毒病的病理机制中有重要作用. 本室已经证明二者可以发生分子间相互作用,本文进一步分析了tau蛋白与prion的体外相互作用及作用位点. 利用RT-PCR方法从人源细胞系SHSY5Y cDNA中扩增出微管相关蛋白tau全长cDNA序列,克隆至质粒pGEX-2T载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白GST-tau. 利用GST pull-down及免疫共沉淀方法检测全长tau蛋白与PrP23-231的分子间相互作用. 进一步表达tau 蛋白的各种缺失突变体,确定tau蛋白与PrP蛋白的相互作用位点. 结果表明,所表达的全长tau蛋白及各种缺失突变体均为可溶性蛋白,Western印迹结果显示,各种蛋白均能很好的被tau蛋白单抗识别. GST pull-down和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的全长tau蛋白可与全长的PrP蛋白在体外发生相互作用,并确定相互作用位点位于tau蛋白的N端序列及中段的重复区. 上述结果为研究tau蛋白与PrP的相互作用在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的理论基础.     

感染羊瘙痒因子263K株或139A株仓鼠脑组织中tau蛋白和磷酸化tau蛋白变化的研究

为探讨朊病毒病的神经病理特征,应用Western blot方法检测了感染羊瘙痒因子263K株或139A株的仓鼠脑组织中总tau蛋白和Ser396和Ser404位点发生磷酸化tau蛋白表达水平的变化;并应用Real Time PCR方法检测了tau mRNAs转录活性的改变。结果表明总tau蛋白含量升高而Ser396和Ser404位点发生磷酸化的tau蛋白含量降低,该现象与羊瘙痒因子毒株类型和临床潜伏期无关;感染羊瘙痒因子的仓鼠脑组织中Tau2和Tau4这两个异构体的转录水平升高。这些结果表明tau蛋白在Ser396和Ser404位点的去磷酸化可能与朊病毒病发病相关。     

PrP及其缺失突变体与微管蛋白的体外相互作用的初步研究

为了进一步确定PrP蛋白与微管蛋白是否发生分子间相互作用以及PrP蛋白多肽链中与微管蛋白相互作用的区域,我们表达纯化了全长的PrP以及PrP蛋白缺失突变体,提取了兔脑组织中天然微管蛋白。利用pull-down及免疫共沉淀方法检测全长PrP及PrP蛋白缺失突变体与微管蛋白是否发生分子间相互作用。结果显示,全长His-PrP23-231能与微管蛋白发生体外相互作用,并首次证实了PrP与微管蛋白相互作用的区域位于PrP N端第23位至91位氨基酸。此研究为进一步研究PrP在神经细胞的主动转运机制以及Prion疾病的发病机制提供了一定的理论基础。     

羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达和分布变化研究

为了探讨羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中星形胶质细胞和神经元的数量及功能改变,利用免疫印迹、免疫组化方法研究了胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)在受染仓鼠各脑区中表达变化的特点,同时比较其与神经病理学改变及PrPSc沉积的关系.结果表明,感染终末期仓鼠的脑组织中GFAP表达量明显增高,与正常对照相比,大脑皮质、脑干和小脑区域GFAP着色细胞数量分别增高3.69、2.41和1.56倍.感染仓鼠脑组织NSE表达量低于正常对照,小脑、海马CA1区和大脑皮质NSE着色细胞数量分别仅为正常对照相应区域的22.5%、54.2%和53.9%.这些变化与PrPSc在脑组织中的沉积程度和空泡样变性程度相吻合.结果提示,GFAP和NSE的检测可分别很好地反映星形胶质细胞和神经元的数量及功能状态,成为在朊病毒病发病过程中重要的病理变化指标.     

羊瘙痒病263K毒株感染的仓鼠脑中PrP分子形式多样性的动态测定

正常细胞的朊蛋白(PrPC)代谢和构象的改变是引发动物和人类可传播性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs)的根本原因。将羊瘙痒病(scrapie)仓鼠适应株263K颅内接种仓鼠,在接种后的第20、40、50、60、70、80天,通过Westernblot动态检测仓鼠脑中PrP存在的形式。结果在接种后第40天,在感染动物脑组织中即检测到PrPSc分子,比临床症状出现的时间早(平均潜伏期为66 7±1 1天),且无糖基化形式的PrP分子所占百分比在接种后期增加明显。除了标准分子量大小(30kD～35kD)的PrP分子外,在感染动物脑中存在着高分子量和低分子量形式的PrP分子。定量分析显示,随着接种潜伏期的延长,不同形式PrP分子的含量也在增加,其中低分子量形式的PrP分子与临床症状的出现密切相关。蛋白去糖基化实验表明,在感染动物脑组织中,除了标准分子量大小的PrP蛋白外,还存在一条更小分子量的PrP条带,而正常动物脑组织仅存在标准大小的PrP分子。低分子量形式的PrP分子具有与全长PrP分子相类似的糖基化模式。结果提示,scrapie263K感染的仓鼠脑组织中存在不同分子形式的PrPSc,其PrP分子的代谢可能不同于正常动物。     

羊瘙痒因子263K感染仓鼠临床终末期脑中αB-晶体蛋白表达的研究

αB-晶体蛋白(αB-crystallin)是小热休克蛋白(Small heat shock protein,sHSP)家族的代表成员,已发现与多种神经退行性疾病发生发展密切相关,但至今为止对αB-晶体蛋白在朊病毒病发生发展中可能扮演的角色研究甚少,作用尚不清楚。本研究利用羊瘙痒因子仓鼠敏感株263K感染仓鼠建立的朊病毒实验动物模型,通过免疫印迹(Western blots)和免疫组织化学染色观察到伴随PrPSc在感染终末期动物脑组织中大量沉积,αB-晶体蛋白表达显著上调,比正常对照增高3倍。免疫荧光双染确定其分布的主要细胞类型为星形胶质细胞,神经元中未检测到表达。感染动物中高表达的αB-晶体蛋白与异常沉积的PrPSc无明显共定位。此研究为进一步探讨和揭示αB-晶体蛋白在朊病毒病中可能的作用和分子机制奠定了基础。     

抗牛PrP多肽单克隆抗体的制备及其在牛PrP 检测中的应用

为获得广谱抗哺乳类动物PrP单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb), 用牛朊蛋白(prion protein, PrP)多肽(209~228 aa)与匙孔槭血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)偶联物免疫Balb/C小鼠. 经细胞融合和克隆后获得针对上述多肽的杂交瘤细胞株. 分别用Western blot和免疫组化(immunohistochemistry, IHC)的方法检测这些McAbs与重组人(human, Hu)、牛(bovine, Bo)、仓鼠(hamster, Ha)PrP蛋白、牛脑组织中的正常朊蛋白(cellular PrP, PrPc)和致病性朊蛋白(scrapie of prion, PrPSc)的反应性. 本文为制备高效价抗PrP McAb提供了一个简单、易行的方法. 制备的抗体可用于研究哺乳类PrP生物学特性, 检测可传播性海绵样脑病, 特别是对牛海绵样脑病的诊断具有重要意义.     

蛋白激酶CK2与PrP蛋白的体外相互作用研究

为了探讨蛋白激酶CK2与PrP是否存在分子间相互作用,利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中分别扩增出蛋白激酶CK2a和CK2β基因,并在E coli中表达了融合蛋白HIS-CK2α和GST-HISCK2β.利用pU-doWn及免疫共沉淀实验检测PrP与CK2的分子间相互作用.结果显示,重组PrP可与CK2α出现特异性结合,但不与CK2β发生反应.天然状态下脑组织中的CK2与PrPc也发生相互作用.PrP与CK2α亚基相互作用的区域位于PrP的C-端90～231位氨基酸.本研究从分子水平上提供了人重组和天然CK2和PrP蛋白相互作用的实验依据,为深入探讨CK2与朊蛋白作用的生物学意义和在朊病毒病发病过程中的作用提供了科学线索.     

朊粒蛋白PrP~(Sc)寡聚体的形成与跨膜毒性

朊粒蛋白(prionprotein,PrP)传染致病机制一直是朊粒(prion)研究领域的焦点.由正常型朊粒蛋白(PrPC)向致病型朊粒蛋白(PrPSc)的转变是致病的关键步骤.本文综述了近年来PrPC向PrPSc转变的结构变化特征、PrPSc由单体形成寡聚体的组装机制、以及PrPSc寡聚体的跨膜机制与细胞毒性间的关系等方面的研究进展.     

朊蛋白相关蛋白Shadoo与朊病毒病

朊病毒病,即传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies, TSEs）,是一类传染性、致死性神经退行性疾病。在朊病毒病的病理过程中,细胞正常朊蛋白PrP。转化为异常构象的PrP是至关重要的,但是PrP‘的正常生理功能仍不清楚。国外学者利用比较基因组学发现了-个新的朊蛋白相关蛋白-shadoo（Sho）。Sho与PrP。在氨基酸序列和细胞定位的相似性及主要在脑组织表达,使它成为-个非常值得研究的PrP相关蛋白。对Sho可能存在的与PrP。重叠的功能甚至直接相互作用的研究工作,将对今后揭示PrPc正常生理功能以及揭示Pfion病发病机制具有重要现实意义。     

与朊毒体相关的鱼类朊蛋白研究概况

疯牛病(mad cow disease),即牛传染性海绵状脑病(bovine transmissible spongiform encephalopathy,BSE)的俗称,是一种慢性消耗性、致死性、中枢神经系统退行性疾病。疯牛病被认为与朊毒体(Prion)有关,朊毒体是由正常朊蛋白(Prion protein,或者PrPC)发生构象改变后形成的异常蛋白(PrPSc)。疯牛病的发生引起了世界各国政府和科学界的高度重视,PrP的起源及其功能研究已成为研究热点。鱼类PrP相关蛋白的研究正在展开中,由于鱼类PrP相关蛋白与朊蛋白的结构相似,鱼类感染TSE类似病存在理论上的风险。本文全面地综述了疯牛病的概况、朊毒体的特性、朊毒体与哺乳动物朊蛋白、鱼类PrP相关蛋白(PrP1、PrP2和PrP3)及鱼类其他PrP相关蛋白的研究情况,为国内水生动物PrP相关蛋白研究提供参考。     

羊瘙痒因子263K毒株感染金黄地鼠后鼠脑组织中检出PrP-res蛋白及其神经病理学研究

羊瘙痒病是累及山羊及绵羊的可传播海绵状脑病。为了观察羊瘙痒因子 (Scrapie)的病原特征及病理组织改变特点 ,将羊瘙痒因子 2 6 3K毒株颅内接种至金黄地鼠。经过 81～ 110天的潜伏期 ,89%的动物发病 (17/19只 )。对发病地鼠的神经病理学检测发现 ,海绵状空泡变性的检出率为 5 9% ,淀粉样斑的检出率为 17 6 %。利用免疫组化和蛋白酶消化后的Westernblotting检测证实 ,10 0 %的发病地鼠的脑组织中都出现蛋白酶抗性朊蛋白 (PrP res)。17只发病地鼠脑组织提取物中 ,PrP res的泳动位置和分子量大小完全一致 ,出现两条分子量在 2 5kD～ 31kD的反应带。尝试应用快速玻片印迹法检测病变组织中的PrP res,结果显示 ,与常规固定包埋切片的免疫组化检出效果相似。这提示脑组织印片法可成为临床检测克 雅氏病 (Creutzfeldt Jacobdisease ,CJD)患者脑组织活检标本中PrP res的快速、有效的方法。羊瘙痒因子 2 6 3K成功感染金黄地鼠再次证明 ,金黄地鼠是TSE感染因子良好的动物模型 ,发病率高 ,潜伏期短 ,发病动物PrP res的检出率明显高于典型病理改变的检出率。新生成的PrP res的电泳类型与接种的TSE因子有关 ,与宿主的个体差异无关 ,提示TSE感染因子的确存在“株”的现象。     

一种基于连续PMCA的PrPSc体外扩增方法的建立

为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测.结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制.连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc.     

单克隆抗体有望用于治疗朊蛋白病

朊蛋白病是一组致命的神经系统变性疾病 ,其特征之一是正常的细胞朊蛋白 (PrPC)转变为有感染性的疾病相关蛋白PrPSc。目前朊蛋白病尚无有效的治疗方法。最近White等的研究表明 :抗朊蛋白单克隆抗体ICSM 18能抑制朊病毒复制 ,延缓朊蛋白病的发展。动物实验表明 ,持续进行这种被动免疫治疗的小鼠健康生长长达 5 0 0天以上 ,且未出现自身免疫反应的副作用 ;而对照组未接受单克隆抗体治疗小鼠的平均存活期仅为 197天左右。该研究表明 ,ICSM 18几乎不与PrPSc结合 ,而与PrPC 有高亲和力 ,其抑制作用呈剂量依赖性。它通过识别PrP的抗原决…     

朊蛋白与信号蛋白14-3-3β的相互作用研究

为进一步确定PrP蛋白与14-3-3蛋白是否发生分子间的相互作用并确定PrP蛋白与14-3-3蛋白相互作用的区域,利用免疫共沉淀、pull down和能量共振转移(FRET)实验检测PrP蛋白与人14-3-3蛋白是否发生分子间的相互作用及相互作用的部位。结果证明,PrP蛋白与人14-3-3蛋白在体外、组织水平及细胞水平均可以发生相互作用,且证实作用的部位在PrP蛋白的106-126位氨基酸。该结果为进一步研究14-3-3蛋白在Prion疾病中的影响及Prion疾病的发病机制奠定了一定基础。     

载脂蛋白ApoE的原核表达以及与PrP蛋白间相互作用的初步研究

利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中扩增出载脂蛋白ApoE基因,并在pET32a载体中表达融合蛋白His-ApoE,以纯化的融合蛋白免疫实验用兔获得特异性抗体,利用ELISA及免疫共沉淀方法对ApoE及PrP之间的相互作用进行研究.结果表明,SDS-PAGE显示表达的His-ApoE蛋白的相对分子量约为54 000,所制备的抗血清ELISA效价可达到1∶406 900,并能够有效地识别重组及动物组织中的内源性ApoE蛋白.ELISA和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的ApoE可与全长的PrP蛋白（PrP23-231）在体外发生相互作用,其作用位点可能位于PrP蛋白的N端.这些结果为TSE经血传播的机制研究提供了新思路.     

青藏高原藏羚羊朊蛋白基因及氨基酸序列分析

羊瘙痒病是一种自然发生的传染性海绵状脑病,它可以在绵羊和山羊羊群之中传播,其疾病的易感性、潜伏期和跨物种传播的能力主要受宿主朊蛋白基因(prion protein gene,PRNP)的影响。研究藏羚羊PRNP有助于明确藏羚羊和羊瘙痒病之间的关系,从而更好地保护藏羚羊。参照GenBank上已经发表的绵羊PRNP序列设计引物,然后对藏羚羊的PRNP序列进行扩增、测序和分析。测序结果显示藏羚羊PRNP序列由771个核苷酸构成,编码256个氨基酸。序列分析结果显示21只藏羚羊PrP(prion protein,PrP)氨基酸序列完全同源,并且与野生型绵羊PrP氨基酸序列完全一致。此外,藏羚羊PrP氨基酸序列与山羊(99.2%)、汤氏瞪羚(99.2%)、印度羚(99.2%)、驯鹿(98%)、马鹿(98%)、家牛(97.7%)和水牛(96.1%)也具有较高的同源性。在对PrP氨基酸序列136、154、171位多态性分析后发现本次收集的21只藏羚羊样本可能和野生型绵羊一样对羊瘙痒病易感。本研究为羊瘙痒病在藏羚羊羊群中可能出现的风险提供了理论依据,提示要加强藏羚羊羊群中羊瘙痒病的监测。     

SMB-S15细胞中朊病毒PMCA方法的建立及对白藜芦醇抗朊病毒作用的评价

朊病毒是一类能引起人或动物神经退行性疾病的感染因子。蛋白质错误折叠循环扩增(Protein misfolding cy-clic amplification,PMCA)是一种常见的朊病毒体外扩增技术。白藜芦醇是一种具有较高研究价值的植物抗菌素。为了建立SMB-S15细胞中朊病毒的PMCA体系,并探索PMCA技术在评价白藜芦醇抗朊病毒作用的意义,本研究以朊病毒感染细胞系SMB-S15细胞匀浆为种子,健康小鼠脑组织匀浆为底物,建立PMCA技术平台。将不同浓度的白藜芦醇导入PMCA体系,通过Western Blot方法检测PMCA产物中异常朊蛋白(PrPSc)的生成和变化。结果显示:SMB-S15细胞中PrPSc可以在建立的PMCA体系有效地复制。新生成的PrPSc分子的糖基化特征与原始细胞中的PrPSc不同,其双糖基化分子比例明显增加。同时也有别于羊瘙痒因子139A和ME7感染小鼠脑组织中的PrPSc分子。加入白藜芦醇后,PrPSc在PMCA体系中的复制明显被抑制,呈现出剂量依赖效应,其EC50约为4.616μM。这些结果表明:SMB-S15细胞中的PrPSc可以通过PMCA大量扩增,建立的PMCA技术可有效地反映白藜芦醇对PrPSc在体外复制的抑制作用。     

禽传染性支气管炎病毒Nsp2蛋白与宿主蛋白eIF2α的互作鉴定

Nsp2蛋白是冠状病毒的非结构蛋白,在病毒早期感染中具有重要作用。【目的】为初步筛选可能与禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV) Nsp2蛋白互作的宿主蛋白,鉴定Nsp2蛋白与真核翻译起始因子2α亚基(eIF2α)的相互作用。【方法】以pCAGGs-Flag-Nsp2和pCAGGs-Flag载体转染后的鸡胚肾(CEK)细胞为研究对象,利用免疫共沉淀(Co-IP)和液相色谱-串联质谱(LC⁃MS/MS)技术筛选出可能与IBV Nsp2蛋白发生互作的宿主蛋白eIF2α,通过免疫共沉淀和间接免疫荧光试验进一步验证二者相互作用。【结果】经免疫共沉淀与质谱分析后筛选到97个可能与Nsp2蛋白互作的宿主蛋白,其中宿主抗病毒反应的关键蛋白eIF2α与Nsp2蛋白的相互作用通过免疫共沉淀和间接免疫荧光试验,表明二者存在直接互作关系,并共定位于细胞质中;此外,Nsp2蛋白表达和IBV感染都能显著提高宿主内源性eIF2α的转录水平。【结论】利用免疫共沉淀联合质谱技术筛选到CEK细胞中存在的97种可能与IBV Nsp2互作的候选蛋白,利用免疫共沉淀与间接免疫荧光证明候选蛋白eIF2α与Nsp2蛋白在细胞质中存在直接互作,同时发现Nsp2蛋白过表达和IBV感染会导致CEK细胞内eIF2α的转录水平显著增强。本研究为进一步探索冠状病毒非结构蛋白Nsp2的生物学功能奠定了基础,并提供了IBV入侵宿主时Nsp2蛋白的作用机制研究的新线索。     

N端八肽重复区数目对人重组PrP与金属离子结合后的蛋白酶抗性及与tau蛋白结合能力的影响

人类朊病毒病中约10％～15％具有家族遗传特性,其中插入或缺失突变多发生于PrP蛋白N末端的八肽重复区域。运用PCR成功地构建并表达了含不同八肽重复数目的PrP蛋白,并观察八肽重复数目的增加对PrP与Cu^2＋等二价离子以及tau蛋白的相互作用的影响。实验结果显示：各种纯化后的PrP蛋白对常规浓度PK消化是敏感的,而与Cu^2＋共同孵育可使PrP蛋白的PK抗性增强;八肽重复序列的数目及Cu^2＋的浓度决定了PK抗性的出现和强弱。另外,MnH可诱导产生与CuH相似的结果,但其诱导效应似乎低于CuH,而Zn^2＋对PrP蛋白的PK抗性无影响。GST—tau包被的ELISA检测证实,重组的PrP呈现出明显的tau蛋白结合能力,并且与八肽重复序列的数量相关,重复序列数量越多,结合能力越强。这些结果提示,CuH诱导产生的PrP蛋白PK抗性是通过八肽重复序列区域产生的,并且直接与重复序列的数量相关。另外,PrP蛋白八肽重复序列的存在和数量直接影响PrP与tau蛋白的结合效应。除了八肽区域外,PrP蛋白其它区域似乎也具有一定的tau蛋白结合能力。