载脂蛋白ApoE的原核表达以及与PrP蛋白间相互作用的初步研究

利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中扩增出载脂蛋白ApoE基因,并在pET32a载体中表达融合蛋白His-ApoE,以纯化的融合蛋白免疫实验用兔获得特异性抗体,利用ELISA及免疫共沉淀方法对ApoE及PrP之间的相互作用进行研究.结果表明,SDS-PAGE显示表达的His-ApoE蛋白的相对分子量约为54 000,所制备的抗血清ELISA效价可达到1∶406 900,并能够有效地识别重组及动物组织中的内源性ApoE蛋白.ELISA和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的ApoE可与全长的PrP蛋白（PrP23-231）在体外发生相互作用,其作用位点可能位于PrP蛋白的N端.这些结果为TSE经血传播的机制研究提供了新思路.     

SMB-S15细胞中朊病毒PMCA方法的建立及对白藜芦醇抗朊病毒作用的评价

朊病毒是一类能引起人或动物神经退行性疾病的感染因子。蛋白质错误折叠循环扩增(Protein misfolding cy-clic amplification,PMCA)是一种常见的朊病毒体外扩增技术。白藜芦醇是一种具有较高研究价值的植物抗菌素。为了建立SMB-S15细胞中朊病毒的PMCA体系,并探索PMCA技术在评价白藜芦醇抗朊病毒作用的意义,本研究以朊病毒感染细胞系SMB-S15细胞匀浆为种子,健康小鼠脑组织匀浆为底物,建立PMCA技术平台。将不同浓度的白藜芦醇导入PMCA体系,通过Western Blot方法检测PMCA产物中异常朊蛋白(PrPSc)的生成和变化。结果显示:SMB-S15细胞中PrPSc可以在建立的PMCA体系有效地复制。新生成的PrPSc分子的糖基化特征与原始细胞中的PrPSc不同,其双糖基化分子比例明显增加。同时也有别于羊瘙痒因子139A和ME7感染小鼠脑组织中的PrPSc分子。加入白藜芦醇后,PrPSc在PMCA体系中的复制明显被抑制,呈现出剂量依赖效应,其EC50约为4.616μM。这些结果表明:SMB-S15细胞中的PrPSc可以通过PMCA大量扩增,建立的PMCA技术可有效地反映白藜芦醇对PrPSc在体外复制的抑制作用。     

爱尔兰国家植物园

幽雅整洁、小巧精致的爱尔兰国家植物园,占地面积仅有19.5公顷,但它却保存了2万余种植物种类。该园始创于1795年,迄今已有208年的历史。最初植物园内以种植粮食作物、牧草和药用植物为主,同时还种了少量的观     

堤岸田鼠(Bank Vole)重组朊蛋白在RT-QuIC反应上的特点及其关键位点的作用探索

堤岸田鼠对很多种属的朊病毒易感。在堤岸田鼠的朊蛋白氨基酸序列中,只有两个位点是同仓鼠和小鼠都不相同的,分别是位于C端的227位和230位。为了评估这两个位点对堤岸田鼠RT-QuIC反应的影响,我们构建了田鼠野生型(Vole-WT),两种突变型(Vole-E227D,Vole-S230R),以及仓鼠野生型(Ha-WT)蛋白用于RT-QuIC反应。结果显示田鼠野生型及两种突变型具有极强的RT-QuIC反应效率。即使在较弱的反应条件下,田鼠野生型及突变型也表现出比仓鼠更高的反应效率。其中Vole-E227D在三种田鼠蛋白中是效率最高的,随后为野生型和Vole-S230R。我们的结果表明堤岸田鼠朊蛋白氨基酸227位和230位不是造成堤岸田鼠RT-QuIC反应如此高的原因,但特定氨基酸位点的改变会在一定程度上影响朊蛋白的RT-QuIC反应效率。     

慢性消耗性疾病的实验室生物安全评价

慢性消耗性疾病是唯一一种在野生和圈养鹿群中共存的朊病毒病,又称可传播性海绵状脑病。该病的病原在中枢神经组织和外周组织中大量富集。病鹿的组织、体液及排泄物污染环境,从而实现该病在鹿群中的水平传播。截至到目前,该病已从最初的美国蔓延至加拿大、韩国、挪威和芬兰。虽然没有直接证据表明慢性消耗性疾病可以感染人类,但是该病对非人灵长类的感染能力提示我们应提高警惕。本文从病原学、宿主、传播途径、预防控制措施等方面综合评价了慢性消耗性疾病的实验室生物安全特点。     

一种基于连续PMCA的PrPSc体外扩增方法的建立

为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测.结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制.连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc.     

细胞浆中PrP蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究

为了探讨在胞浆中表达的PrP的理化特征以及对细胞活性的影响,我们构建了胞浆型PrP(CytoPrP)真核表达质粒,瞬时转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,通过蛋白酶敏感性实验检测CytoPrP及其蛋白酶抗性,利用MTT和Trypan Blue细胞计数检测CytoPrP的细胞毒性作用.结果显示,CytoPrP在胞浆内的存在受蛋白酶抑制剂的控制;与野生型PrP相比,CytoPrP具有相对较强的蛋白酶K(PK)抗性.MTT和细胞计数实验均显示,Cyto-PrP的存在可诱导明显的细胞毒性效应,而CytoPrP的细胞毒性作用受蛋白酶抑制剂含量的影响,呈剂量依赖关系.上述结果为研究CytoPrP在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的科学数据.     

HPV-2E2蛋白(A338V)突变体对E2蛋白DNA结合能力增强的研究

HPV-2是引起皮肤寻常疣的常见HPV型别,病毒E2蛋白可抑制病毒早期启动子的活性。我们曾经报道来自一例巨大寻常疣患者的HPV-2突变E2蛋白对病毒早期启动子活性的抑制作用明显减弱,该E2蛋白在其C末端的DNA结合区域带有A338V的点突变。本研究利用原核表达系统表达纯化了突变E2(A338V)和HPV-2原毒株的羧基端和全长蛋白。电泳迁移率实验结果显示,E2蛋白可与带有E2蛋白特异性结合位点的寡核苷酸探针形成复合物,突变E2蛋白比原毒株E2蛋白的DNA结合能力强。这提示DNA结合能力的增强可能为E2蛋白对病毒启动子活性影响的分子基础,与患者出现罕见巨大寻常疣这一临床表型关联。     

蛋白激酶CK2与PrP蛋白的体外相互作用研究

为了探讨蛋白激酶CK2与PrP是否存在分子间相互作用,利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中分别扩增出蛋白激酶CK2a和CK2β基因,并在E coli中表达了融合蛋白HIS-CK2α和GST-HISCK2β.利用pU-doWn及免疫共沉淀实验检测PrP与CK2的分子间相互作用.结果显示,重组PrP可与CK2α出现特异性结合,但不与CK2β发生反应.天然状态下脑组织中的CK2与PrPc也发生相互作用.PrP与CK2α亚基相互作用的区域位于PrP的C-端90～231位氨基酸.本研究从分子水平上提供了人重组和天然CK2和PrP蛋白相互作用的实验依据,为深入探讨CK2与朊蛋白作用的生物学意义和在朊病毒病发病过程中的作用提供了科学线索.     

线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone和积雪草酸对朊病毒感染的神经细胞的治疗作用研究

朊病毒病(Prion diseases)是一类具有致死性、传染性和进行性的神经退行性疾病。研究发现朊病毒感染的细胞和动物模型中均存在着线粒体功能异常和氧化应激,这很有可能在朊病毒病发生发展中起重要作用。为探究线粒体靶向抗氧化剂对朊病毒感染是否具有一定的治疗作用,我们选出两种线粒体靶向抗氧化剂,以一定浓度作用于朊病毒感染神经细胞系,并观察细胞活性和线粒体功能的变化情况。结果显示,Mitoquinone(MitoQ)和积雪草酸(Asiatic acid,AA)这两种药物能够显著提高朊病毒感染细胞的活性,降低其活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,上调ATP5β的表达水平,提示这两种药物对朊病毒感染细胞有一定的治疗作用,本研究为朊病毒病发病机制以及治疗的研究提供了新的思路。