免疫共沉淀筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白相互作用的蛋白

摘要：【目的】筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白（A/M2）相互作用的蛋白质。【方法】将A/M2编码序列插入真核表达载体pCAGGS-CFlag,重组质粒pCAGGS-CFlag-A/M2转染HEK-293T细胞,裂解细胞,以Flag单抗偶联的琼脂糖球珠免疫沉淀A/M2-Flag蛋白,清洗去除非特异性结合的杂蛋白后,SDS-PAGE银染法显示与A/M2共沉淀的蛋白,从胶上切下此蛋白条带进行质谱分析。【结果】成功构建了A/M2的表达质粒,免疫印迹证实了A/M2蛋白在293T细胞中能够表达,免疫共沉淀筛选到与A/M2结合的多种蛋白,分析质谱结果,确定ataxin 10和3个真核翻译起始因子(eIF)为候选蛋白。【结论】ataxin 10与A/M2相互作用为流感病毒感染或接种流感疫苗引发小脑性共济失调提供了解释,eIF与A/M2相互作用表明A/M2可能在调控病毒蛋白合成方面起重要作用。     

猪δ冠状病毒核衣壳蛋白互作的蛋白鉴定及分析

初步筛选与鉴定PDCoV N蛋白的宿主互作蛋白.利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)和LC-MS/MS质谱技术筛选出PDCoVN蛋白的宿主互作蛋白,并进行生物信息学分析,再利用免疫共沉淀进行鉴定.通过免疫共沉淀产物的SDS-PAGE分析发现在40 kD和100 kD左右有明显的差异蛋白条带,通过质谱筛选到了68个与PDCoVN蛋白互作的宿主蛋白,并做了GO、COG和KEGG注释,挑选出2个候选互作蛋白,经过免疫共沉淀验证,PDCoVN蛋白与TUBB2B存在互作关系.该研究为进一步探索PDCoV N蛋白在病毒感染细胞时的作用提供了新方向.     

运用BioID技术筛选S100A7互作蛋白*

目的: 通过邻近生物素鉴定(BioID)技术筛选S100A7互作蛋白并进行验证。方法: 采用邻近生物素BioID和质谱相结合的方法,筛选S100A7互作蛋白。通过免疫荧光和免疫共沉淀方法,对相互作蛋白进行验证。结果: 与对照组比对,通过BioID技术共获得94个可能与 S100A7 相互作用的候选蛋白质。选取 Annexin A2(AnxA2)蛋白在 HEK293 细胞中进行了验证,结果表明S100A7 与 AnxA2 存在直接的相互作用,且二者共定位于细胞质和细胞膜。结论: 可将BioID技术作为互作蛋白筛选的一项新技术,通过该技术发现S100A7和AnxA2存在相互作用。     

与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定

【背景】猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)膜蛋白(M)在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用,但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。【目的】利用免疫沉淀技术和液质联用技术筛选细胞内与PEDVM蛋白相互作用的蛋白,为揭示M蛋白在病毒增殖过程中发挥的功能提供研究基础。【方法】将MOI=0.1的PEDV DR13疫苗株接种于长成单层的Vero细胞,感染36 h后,收集细胞并进行裂解。利用抗M的单克隆抗体沉淀与M相互作用蛋白复合物,通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴定并利用细胞功能富集分析(Gene ontology,GO)对感染组鉴定到的细胞蛋白进行分析,确定两个细胞内源性蛋白为候选蛋白,进行免疫共沉淀(Co-IP)验证和共定位分析。【结果】基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了218个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42 (Cell division cycle 42,CDC42)、真核翻译起始因子3亚基L蛋白(eIF3L)为候选蛋白进行Co-IP(Co-immunoprecipitation)验证和共定位分析,结果证实CDC42、eIF3L蛋白分别与M蛋白在细胞内存在相互作用。【结论】鉴定出PEDV M蛋白能够与宿主细胞CDC42和eIF3L蛋白相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白60个,为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。     

禽传染性支气管炎病毒E蛋白单抗制备及其互作宿主蛋白初步鉴定分析

本研究利用原核表达系统成功表达禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）的小囊膜蛋白（Envelope protein, E），并首次制备E蛋白的单克隆抗体。在此基础上，采用免疫共沉淀（IP）及质谱鉴定的方法，寻找宿主细胞中与IBV E蛋白发生相互作用的宿主蛋白。通过GO分析和KEGG通路富集分析，预测与IBV E蛋白具有潜在互作的宿主蛋白在病毒感染过程中可能发挥的生物学功能。本研究为进一步探讨E蛋白在IBV病毒复制过程中的具体作用提供了研究工具和基础研究数据。     

与PRRSV nsp11互作的宿主细胞蛋白鉴定及生物信息学分析

【目的】研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp11与宿主细胞蛋白之间的相互作用,对于揭示nsp11在病毒复制过程中发挥的功能至关重要。【方法】在病毒感染细胞的基础上,利用nsp11的单克隆抗体,采用免疫沉淀结合串联质谱的方法,筛选与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,并对所筛选出的宿主细胞蛋白进行了GO注释、COG注释和KEGG代谢通路注释;选取筛选出的宿主细胞蛋白IRAK1,利用免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术鉴定其与nsp11之间的相互作用。【结果】与空白对照组相比,病毒感染组中出现3条差异带;经质谱分析共筛选得到了201个与nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,分别与蛋白质代谢、细胞信号通路转导以及病原致病性等密切相关;在生物信息学分析的基础上,实验验证了nsp11确与宿主细胞蛋白IRAK1进行相互作用。【结论】鉴定出与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,生物信息学分析显示它们在病毒的复制和致病过程中发挥重要作用。研究结果为探究nsp11的生物学功能指明了方向,也为研究宿主细胞蛋白与病毒蛋白间的相互作用及其调控病毒复制和致病性的分子机制奠定了基础。     

家蚕微孢子虫与家蚕ECH1和GAPDH蛋白的相互作用

【目的】在分子层面上研究家蚕微孢子虫Nosema bombycis与家蚕Bombyx mori蛋白的相互作用,初步探讨家蚕微孢子虫向家蚕细胞能量中心靠近的原因。【方法】采用Far-western blot分析与家蚕微孢子虫具有相互作用的家蚕中肠蛋白,质谱鉴定筛选出候选蛋白。PCR扩增候选蛋白的基因,连接到p ET30a载体并转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞培养,测序选取正确的3个重组质粒,转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中诱导表达候选蛋白,亲和层析柱纯化候选蛋白,制备多克隆抗体。用免疫共沉淀和间接免疫荧光技术验证候选蛋白与家蚕微孢子虫的相互作用。【结果】Far-western blot筛选到的anti-SWP9和anti-SWP5抗体与感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠总蛋白的PVDF膜孵育,分别在26 k D和34 k D处检测到一条特异条带,说明家蚕微孢子虫与26 k D和34 k D的家蚕中肠蛋白发生了相互作用。对质谱鉴定结果进行蛋白质的分子量、肽段数以及功能的分析,筛选出与家蚕微孢子虫相互作用的候选家蚕蛋白烯酰辅酶A水合酶(ECH1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和3-羟酰辅酶A脱氢酶(HCDH)。利用制备的能够特异识别ECH1,GAPDH和HCDH 3种蛋白的多克隆抗体anti-ECH1,anti-GAPDH和anti-HCDH进行免疫共沉淀,证实了家蚕微孢子虫与家蚕中肠蛋白ECH1和GAPDH具有相互作用;间接免疫荧光分析结果进一步说明GAPDH能与家蚕微孢子虫特异性结合。【结论】家蚕微孢子虫可以和家蚕蛋白ECH1和GAPDH特异性结合。由于ECH1是定位于线粒体膜上的脂肪酸β-氧化的关键酶,GAPDH是糖酵解途径的关键酶,推测家蚕微孢子虫可能通过和家蚕ECH1和GAPDH的相互作用,在空间上靠近宿主细胞的线粒体和糖酵解途径,便于摄取宿主细胞脂肪酸β-氧化和糖酵解途径产生的中间产物和ATP,满足家蚕微孢子虫的物质和能量需求。     

转录因子AP-2β与SLP-2的蛋白相互作用

AP-2β是转录因子AP-2家族中的重要一员.AP-2是一个与哺乳动物的发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生都有密切联系的重要的转录因子家族.最近的研究表明,AP-2能通过与其他蛋白的相互作用来调控AP-2下游基因的转录活性.采用免疫共沉淀结合质谱鉴定的方法筛选与AP-2β相互作用的蛋白.结果筛选到Stomatin like protein2(SLP-2)蛋白可能与AP-2β相互作用.免疫共沉淀实验证实外源过表达和内源的SLP-2蛋白都能与AP-2β蛋白相互作用.而且,细胞免疫荧光实验发现外源表达的Myc-AP-2β蛋白与内源的SLP-2蛋白在MCF-7细胞的胞质中有共定位.此外,免疫印记实验结果表明过表达SLP-2能上调AP-2β的蛋白水平,这就表明SLP-2与AP-2β相互作用后,SLP-2可能使AP-2β蛋白更稳定.这些研究结果为进一步研究这两个基因的功能提供了新的切入点.     

A型流感病毒PB1-F2蛋白与MOAP-1的相互作用

【目的】探讨A型流感病毒PB1-F2蛋白和人类凋亡调节因子1(MOAP-1)之间的相互作用。【方法】构建pACT2-MOAP-1重组质粒,与pGBKT7-PB1-F2质粒共转化酵母AH109,检测转化菌在四缺培养基的生长情况及β半乳糖苷酶报告基因的活性;利用GST pull-down和免疫共沉淀(Co-IP)技术进一步验证PB1-F2与宿主细胞蛋白MOAP-1的相互作用;通过过表达PB1-F2和MOAP-1,检测PB1-F2对MOAP-1蛋白表达水平的影响。【结果】酵母双杂交结果表明,PB1-F2和MOAP-1可以在酵母细胞内特异性结合。GST pull-down和Co-IP实验也进一步证实了这两种蛋白的相互作用,而且PB1-F2可上调外源MOAP-1的蛋白水平。【结论】流感病毒PB1-F2与MOAP-1存在相互作用,PB1-F2可能通过与MOAP-1的相互作用参与调控细胞生长及凋亡过程。     

KPNB1和Ran蛋白共同介导新城疫病毒基质蛋白的入核转运

【目的】鉴定与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质蛋白(matrix protein,M)入核相关的细胞蛋白,以阐明NDV M蛋白细胞核定位的分子机制。【方法】从鸡胚成纤维细胞中分别克隆核转运受体蛋白KPNA1–KPNA6和KPNB1基因,将其构建到真核表达载体,并与表达NDV M蛋白的重组真核表达载体分别共转染HEK-293T细胞,通过免疫共沉淀方法鉴定与NDV M蛋白相互作用的核转运受体蛋白。另外,将M蛋白与Ran蛋白突变体或与M蛋白互作的核转运受体蛋白缺失体分别共表达,通过荧光共定位确定M蛋白入核转运相关的细胞蛋白。【结果】构建的重组真核表达载体在HEK-293T细胞中能够正确表达;通过间接免疫荧光观察发现,重组蛋白中除Myc-KPNA2蛋白定位在细胞质外,其它核转运受体蛋白均与M蛋白表现出相同的细胞核定位。免疫共沉淀试验结果表明,M蛋白与KPNA1蛋白和KPNB1蛋白均存在相互作用。进一步通过荧光共定位观察发现,M蛋白与KPNA1蛋白缺失体(DN-KPNA1)共表达不改变M蛋白的细胞核定位,而与KPNB1蛋白缺失体(DN-KPNB1)共表达后导致M蛋白变为细胞质定位,说明M蛋白入核转运需要KPNB1蛋白的参与。另外,将M蛋白与Ran蛋白突变体Ran-Q69L共表达,荧光观察发现M蛋白同样由细胞核定位变为细胞质定位,说明M蛋白入核转运还需要Ran蛋白的辅助。【结论】KPNB1和Ran蛋白共同介导NDV M蛋白的入核转运,其过程是KPNB1蛋白首先和M蛋白发生相互作用并形成复合物,然后通过Ran蛋白的辅助作用完成入核转运。     

非洲猪瘟病毒D1133L蛋白增加宿主波形蛋白磷酸化而促进病毒在猪巨噬细胞中的复制

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry, IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin, VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的siRNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay, IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。     

拟态弧菌OmpU蛋白在草鱼肠组织中互作蛋白的筛选鉴定

【目的】为了确定草鱼肠组织蛋白中能与拟态弧菌OmpU黏附素蛋白发生互作的蛋白。【方法】在前期构建重组表达质粒pET-32a-OmpU基础上,通过IPTG诱导表达及亲和层析纯化获得可溶性His-OmpU融合蛋白,经Western blot分析显示该重组融合蛋白与OmpU多克隆抗体具有良好的反应原性。以His-OmpU融合蛋白为诱饵蛋白,利用His-tag pull down试验筛选草鱼肠组织蛋白中与OmpU黏附素蛋白结合的蛋白,并经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索。【结果】共鉴定出5个体外互作蛋白,分别为α-肌动蛋白2(α-Actin 2)、细丝蛋白A(Filamin A)、α-辅肌动蛋白4(α-Actinin 4)、转胶蛋白2(又称肌动蛋白结合蛋白2,Transgelin-2)和调宁蛋白2(Calponin-2)。【结论】GO功能注释分析显示,这些互作蛋白属于细胞骨架蛋白和细胞骨架调节蛋白,在病原菌的黏附、内化和致病中起着重要作用。研究结果为后期研制黏附拮抗剂和探究拟态弧菌分子致病机理奠定了基础。     

黑腹果蝇头部中RNA结合蛋白RBP9的互作蛋白筛选

【目的】筛选RNA结合蛋白RBP9在黑腹果蝇Drosophila melanogaster头部中的互作蛋白。【方法】利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，分别将3×Flag和V5标签编码序列插入到黑腹果蝇成虫头中RBP9和FNE基因起始密码子ATG的后面，构建黑腹果蝇转基因品系3×Flag-RBP 9/3×Flag-RBP9(3FRBP9)和V5-FNE/V5-FNE(VFNE)；利用免疫沉淀和质谱法鉴定黑腹果蝇3FRBP9和野生型品系成虫头部中RBP9的互作蛋白并进行生物信息学分析。利用免疫共沉淀方法检测RBP9与FNE蛋白之间的相互作用。【结果】质谱法从黑腹果蝇成虫头部共鉴定了190个与RBP9相互作用的蛋白，其中包括ELAV和FNE。KEGG富集分析显示这些蛋白的基因主要参与核糖体、碳代谢、三羧酸循环、氨基酸生物合成等通路。免疫共沉淀实验结果验证了RBP9与FNE蛋白之间存在相互作用。【结论】RNA结合蛋白ELAV家族成员在黑腹果蝇成虫头部中具有相互作用。本研究为RBP9在果蝇神经系统发育中的功能研究提供了重要实验依据。     

宿主细胞内SARS-CoV N蛋白相互作用蛋白的筛选与鉴定

SARS-CoVN蛋白可与病毒RNA形成复合物,也可与病毒或宿丰细胞中多种蛋白质相互作用,影响宿主细胞的多个信号转导通路,干扰宿主细胞的细胞周期,从而改变宿主细胞的生命活动.利用酵母双杂交技术筛选了15个宿丰细胞内与SARS-CoVN蛋白的相互作用蛋白,其中包括信号传导组分7种,蛋白激酶3种,细胞因子2种,未知功能蛋白3种.并利用免疫共沉淀方法进一步证实了趋化因子CXCL16是宿主细胞与SARS-CoV核衣壳蛋白的相互作用蛋白.     

免疫共沉淀结合微流控芯片技术筛选GBLP相互作用蛋白

为了进一步阐明G蛋白β亚基2样1蛋白（guanine nucleotide-binding protein subunit beta 2-like 1,GBLP）在普萘洛尔（propranolol,PRO）生物学效应发生机制中的作用,采用免疫共沉淀法结合液相色谱-芯片-离子阱串联质谱（HPLC-CHIP-IT-MS/MS）系统筛选并鉴定人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）中的GBLP相互作用蛋白.结果表明,有7种蛋白与GBLP存在相互作用,分别为酪蛋白α-S1、酪蛋白α-S2、β酪蛋白、桥粒芯蛋白1前体、α-烯醇化酶、果糖二磷酸醛缩酶C、硫氧还原蛋白过氧化物酶2.这些蛋白的生物信息学检索结果提示,GBLP可能参与了细胞的能量代谢调节和抗氧化机制,与普萘洛尔的生物学效应发生机制密切相关.     

家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶NbHK对家蚕基因表达及相关通路的调控作用

【目的】微孢子虫是一种营专性细胞内寄生的微生物,它可以感染几乎所有动物种类,包括人类和重要的经济动物。本研究对家蚕微粒子虫分泌蛋白己糖激酶(Nosema bombycis hexokinase, NbHK)在家蚕胚胎细胞中表达特征、亚细胞定位、调控作用和宿主互作蛋白质进行了系统分析,为阐明该蛋白在侵染中的作用与机理提供参考。【方法】利用原核表达蛋白免疫小鼠,制备NbHK的多克隆抗体,并利用Western blotting和间接免疫荧光法分析家蚕微粒子虫在感染的家蚕胚胎细胞(Bombyx mori embryo, BmE)中的表达和定位;通过过表达和RNA干扰实验,分析NbHK对病原增殖的作用;利用RNA-seq分析NbHK调控的家蚕基因表达和通路;利用生物素-链霉亲和素系统和质谱技术,从NbHK::APEX2转基因细胞中分离鉴定NbHK的互作蛋白。【结果】在感染家蚕微粒子虫的BmE中,NbHK持续上调表达,主要被定位于宿主细胞核内。过表达NbHK显著促进了病原增殖,而敲低NbHK则明显抑制了病原增殖,说明在NbHK感染过程中发挥关键作用。利用RNA-seq分析鉴定了94个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中58个基因上调,36个基因下调。DEGs的富集分析显示,细胞寿命和内质网蛋白加工通路受到显著激活,而线粒体自噬途径受到明显抑制。互作蛋白鉴定分析发现,NbHK可能与宿主细胞核内的核蛋白易位启动子区(nucleoprotein translocated promoter region, NTPR)等蛋白间存在相互作用。【结论】NbHK主要被定位至家蚕细胞核中,调控家蚕细胞寿命等多个重要通路的基因表达,以利于病原增殖。本研究为深入解析NbHK在感染过程中的功能及其调控机理提供了新的参考。     

A型塞内卡病毒2C蛋白通过STING调控IFNβ、TNF-α和IL-6的表达

【背景】A型塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)是新发猪塞内卡病毒病的病原,属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)的单股正链RNA病毒。可引起新生仔猪死亡和成年猪口、蹄部出现水泡。先天免疫是宿主抵御病毒入侵的第一道防线,但SVA与宿主抗病毒先天免疫的相互作用机制尚不清楚。【目的】探究SVA非结构蛋白2C在先天免疫应答中的作用机制。【方法】利用SVA感染和通过在猪PK-15细胞中过表达SVA2C蛋白,利用RT-qPCR和Western blotting分析2C蛋白对细胞因子表达及其关键信号通路的影响。【结果】RT-qPCR检测发现,SVA感染PK-15细胞导致IFNβ、TNF-α和IL-6表达的显著升高;同时,SVA感染导致TBK1和NF-κB的磷酸化。进一步的研究发现,SVA的2C蛋白能够激活TBK1和NF-κB磷酸化,并诱导IFNβ、TNF-α和IL-6的表达;2C蛋白能够激活抗DNA病毒感染关键蛋白干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)磷酸化,敲除STING抑...     

沙眼衣原体包涵体膜蛋白CT225与宿主波形蛋白存在相互作用

【背景】衣原体独特的发育周期是在包涵体内完成的,大约7%-10%的基因编码包涵体膜蛋白,由此可见包涵体膜蛋白可能在其发育和致病过程中发挥重要作用。然而,其具体功能仍有待深入研究。【目的】筛选包涵体膜蛋白CT225的互作分子,以期进一步了解其可能的生物学功能。【方法】首先表达融合蛋白GST-CT225,用亲和层析法从HeLa细胞裂解液中筛选CT225的互作分子,所得蛋白进行质谱分析。确定候选蛋白,然后通过免疫共沉淀方法(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)、谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)下拉/沉降实验和亚细胞定位等方法进行验证。【结果】参考质谱分析得分,通过实验初步验证得出波形蛋白(Vimentin,VIM)为与CT225相互作用的蛋白。【结论】CT225与HeLa细胞的波形蛋白Vimentin互相作用,提示其功能可能与维持细胞骨架完整性、膜运输和脂质转运等有关。     

NLS-RARα蛋白相互作用蛋白的筛选与验证

急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特征性染色体易位,产生的PML-RARα融合基因在其发生发展中有重要作用．PML-RARα融合蛋白在细胞内被中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)切割为PML突变蛋白(核定位信号NLS缺失)和RARα突变体 (NLS-RARα,包含有PML的核定位信号),这两段蛋白质在APL的发生中可能具有重要作用．为进一步研究NLS-RARα的生物学功能,运用酵母双杂交技术在白血病cDNA文库中筛选与其作用的蛋白质．首先PCR技术扩增NLS-RARα编码序列,克隆至诱饵载体pGBKT7,测序鉴定后将其转化酵母AH109．免疫印迹检测到诱饵蛋白表达后,将含有诱饵载体的AH109与含有白血病cDNA文库的酵母Y187交配,在含有X-α-gal的营养缺陷性培养基上选择和筛选二倍体酵母．经回转实验和测序分析验证得到8个与NLS-RARα相互作用的蛋白质．为进一步验证这些相互作用,克隆其中的JTV-1蛋白,利用间接免疫荧光,GST pull-down和免疫共沉淀技术成功验证了它与NLS-RARα的相互作用．为进一步探讨APL的发生机制提供了新的线索．     

原癌基因LMO3相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的 通过筛选LMO3的相互作用蛋白,进一步了解LMO3的作用及可能机制。方法酵母双杂交方法筛选LMO3相瓦作用蛋白,并通过酵母结合试验、免疫共沉淀及荧光共定位等进行验证。结果在初步获得相互作用蛋白：钙-整合素结合蛋白（Calcium—and integrin—binding protein,CIB）的基础上,在酵母中证实了LMO3与CIB的相互作用,并通过酵母结合试验确定了CIB与LMO3的相互作用位点,发现CIB可与LMO3的第一个LIM结构域（LIMI）及全长LMO3结合,免疫共沉淀试验确证了它们可以在真核细胞内结合,荧光共定位表明与CIB的相互作用可使LMO3在C8细胞中的定位由细胞核移到细胞质。结论LMO3可以与CIB在真核细胞中发生相互作用,提示LMO3可能通过与CIB的相互作用参与细胞相关功能的调节。