利用比较基因组学方法对猪BAC DNA序列分析来研究抑肌素基因的调控

抑肌素(GDF8, MSTN)是调控骨骼肌发育的TGF-b超家族的一员. 作为负调节因子, 抑肌素通过控制肌纤维的大小和数量来调控骨骼肌的发育. 为了更深入研究它的表达和调控模式, 我们利用比较基因组学方法对一个大约170 kb的猪BAC序列与人和小鼠的相应序列进行了分析, 这段基因组序列的特点是富含分散型重复而G+C含量较低. 抑肌素基因的同源性在猪、人和小鼠3种生物之间非常高, 正如所希望的, 在人与猪之间的同源性高于它们与小鼠的同源性. 一个有意思的特征是在抑肌素启动子CCAAT盒下游有两个TA盒, 进一步分析表明TA盒1负责在人、猪中转录, 而TA盒2在小鼠中起作用; 另一个的特征是在猪抑肌素3′UTR有两个polyA信号序列(AATAAA). 进而, 我们在进化保守区域分析到许多潜在的转录因子结合位点, 它们可能与抑肌素的调控有关. 许多潜在的转录调控因子在肌肉的发育中起重要作用, 暗示着抑肌素与这些因子的复杂相互作用可能是正常肌肉发育所必需的(文中所提到的序列已提交到GenBank, 序号为: AY208121).     

利用比较基因组学方法对猪BACDNA序列分析来研究抑肌素基因的调控

抑肌素(GDF8, MSTN)是调控骨骼肌发育的TGF-b超家族的一员. 作为负调节因子, 抑肌素通过控制肌纤维的大小和数量来调控骨骼肌的发育. 为了更深入研究它的表达和调控模 式, 我们利用比较基因组学方法对一个大约170 kb的猪BAC序列与人和小鼠的相应序列进行了分析, 这段基因组序列的特点是富含分散型重复而G+C含量较低. 抑肌素基因的同源性在猪、人和小鼠3种生物之间非常高, 正如所希望的, 在人与猪之间的同源性高于它们与小鼠的同源 性. 一个有意思的特征是在抑肌素启动子CCAAT盒下游有两个TA盒, 进一步分析表明TA盒1负责在人、猪中转录, 而TA盒2在小鼠中起作用; 另一个的特征是在猪抑肌素3′UTR有两个polyA信号序列(AATAAA). 进而, 我们在进化保守区域分析到许多潜在的转录因子结合位 点, 它们可能与抑肌素的调控有关. 许多潜在的转录调控因子在肌肉的发育中起重要作用, 暗示着抑肌素与这些因子的复杂相互作用可能是正常肌肉发育所必需的(文中所提到的序列已提交到GenBank, 序号为: AY208121).     

猪CFL2b 基因cDNA克隆初步分析

利用基因表达谱芯片分析法筛选出与大白猪高肌肉产量-肌纤维形成有关的CFL2b基因.参考人和小鼠CFL2b基因序列,采用SMART-RACE技术结合EST序列拼接技术,从猪骨骼肌肌肉中首次克隆了猪CFL2b的全长cDNA序列（GenBank登录号EU561660,EU561661）,Northern杂交检测CFL2b基因 mRNA.结果表明,猪CFL2b基因含有2个转录本,长转录本3　012 bp,短转录本1　466 bp .CFL2b基因在多种真核生物中都有表达,且编码区序列非常保守,开放式读码框501 bp编码了166个氨基酸的蛋白质.氨基酸序列分析表明,猪CFL2基因与人和小鼠氨基酸同源性分别为100%和99.1%.核苷酸序列相似性分别为88.1%和74.9%.     

LncRNA调控骨骼肌发育的分子机制及其在家养动物中的研究进展

骨骼肌是维持机体功能必不可少的组织,与家养动物的产肉率等重要经济性状密切相关。近年来,高通量测序鉴定了大量与骨骼肌生成相关的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA),它们可作为调节因子在表观调控、转录调控以及转录后调控等多个层面调控基因表达。lncRNA通过靶向关键因子参与调控骨骼肌发育的各个环节,包括骨骼肌干细胞增殖、迁移、分化,成肌细胞增殖、分化、肌管融合,肌纤维肥大和纤维类型转换等过程。本文重点归纳了lncRNA在人和小鼠骨骼肌发育中的分子调控机制,介绍了lncRNA的研究方法,综述了lncRNA在家养动物骨骼肌发育中的研究进展,分析了目前家养动物lncRNA研究所面临的困难和挑战,最后展望了未来家养动物lncRNA研究的方向,以期为进一步阐明骨骼肌生长发育的分子调控机制提供参考。     

猪POU1F1基因5’侧翼区克隆及序列分析

POU1F1基因是POU基因家族的成员之一,对哺乳动物的早期发育和相关基因启动表达起重要的调控作用。本文利用染色体步移技术,从长白猪基因组中首次克隆到了约1．5kb的POU1F1基因5’侧翼区序列,并利用相关软件对其进行了序列分析和物种间POU1F1基因5’侧翼区序列比对及进化树构建。结果表明所克隆的片段中含典型的TATA盒（-57）和类CAAT盒序列（-87）。TESS软件分析发现在启动子附近有一系列潜在的重要的转录因子结合位点。序列比对结果表明不同物种POU1F1基因的转录起始点上游-150bp区域保守性较强,可能是启动子的核心序列。其中猪与牛的同源性最高,其次是黑猩猩、人、狗,与大鼠、小鼠和鸡同源性较低,与斑马鱼序列同源性最低。同源序列主要集中在转录起始点上游-150bp至-1000bp区域。Vista中的MLAGAN程序构建的系统进化树真实反应了物种间进化关系。     

猪的骨骼肌生长发育研究进展

瘦肉率对生猪产业来说是一个极其重要的经济指标,而这一指标完全取决于骨骼肌的生长发育。因此,猪骨骼肌生长发育机理的研究是十分必要的。然而,在早期由于各种因素的限制,猪骨骼肌单个基因的研究一直进展缓慢;相反,以小鼠为模型,其骨骼肌单基因的功能研究却取得了较大进展。在这一时期,影响肌决定和肌分化的基因,如MRFs家族和MEF2家族相继被发现,这些基因在猪的肌肉发育中也发挥着同样的作用。然而,这些结果并不能很好地揭示骨骼肌发育过程中复杂的基因间互作关系。随着近年来芯片和测序技术的不断发展,更多人试图从整个转录谱的水平来阐述猪肌肉发育的分子机理,并且也取得了较大的进展。为了对猪骨骼肌生长发育有一个更为清晰的认识,该文将以目前猪骨骼肌生长发育研究结果为基础,同时结合模式动物小鼠骨骼肌单基因的研究成果,对猪的骨骼肌生长发育分子调控机理进行详细的阐述。     

骨骼肌发育的分子遗传学

综述了近年来对骨骼肌发育中分子信号途径和MDFs家族成员调控作用的研究进展.MDFs可以直接控制肌肉结构基因的表达,也可以激活中间调控因子或它们共同控制肌源性表型.调控因子MEF2能作为MDF作用的媒介.Pax-3是肌肉发育的早期阶段中必不可少的.心肌和骨骼肌组织之间有许多相似性,二者基因表达的调控途径也有某种程度的保守性.     

肌肉生长抑制素基因5′调控区的多态性与大白猪的早期生长有关

肌肉生长抑制素(myostatin, 简称抑肌素, 又称GDF8)是骨骼肌发育的负调节因子. 本研究对猪抑肌素基因5′调控区的序列进行了克隆, 对该区段的多态性及其与大白猪初生重和早期生长的关系进行了分析. 结果表明, 猪抑肌素基因5′调控区的序列存在长度多态性和单核苷酸多态性(SNP), 其中, 在435和447位点, 由PCR-SSCP判定的2个等位基因(A和B)核苷酸序列不同: A等位基因分别为A和G, B等位基因则分别为G和A. 在所检测的大白猪群体中A和B等位基因的频率分别为0.525和0.475; 所检测的9头莱芜猪中4头为AA型, 5头为AB型, 未检测到BB型. 本研究首次发现等位基因B对大白猪21日龄(P<0.01)、28日龄(P<0.05)和70日龄体重(P<0.05)以及0~21日龄(P<0.01)、0~28日龄(P<0.05)和21~70日龄(P<0.01)的日增重等早期生长性状均具有有利效应, 加性效应值分别为(0.596±0.205)(P=0.0041), (0.498±0.200)(P=0.0136)和(1.409±0.551) kg (P=0.0112)以及(28.39±9.74)(P=0.0041), (17.78±7.15)(P=0.0136)和(37.00±16.92)g (P=0.0304), 均达到显著或极显著水平. 而对28~70日龄的日增重, 尽管BB基因型个体有较高的日增重, 但差异不显著(P>0.1).     

转基因高表达卵泡抑素1对斑马鱼肌肉生长促进作用研究

抑肌素是转化生长因子β超家族成员,其主要功能是对肌肉的生长发育起负调控作用.在哺乳动物中,抑肌素信号是通过其特异性的与激活素受体ⅡB亚基结合而发挥作用.因此,其信号传递作用可以被其结合蛋白以及ActR ⅡB的结合蛋白卵泡抑素所抑制.在小鼠肌肉组织中,高表达卵泡抑素可以导致肌肉组织肌纤维的增生和肥大.为了研究鱼类卵泡抑素...     

鱼类肌肉组织发生和分化相关基因的研究进展

鱼类骨骼肌由两种分布位置不同的肌纤维组成,一种是位于皮下浅层的慢收缩红肌纤维,另一种是构成躯体绝大部分的快收缩白肌纤维.肌肉组织中含有多种不同类型的蛋白质如具有收缩功能的结构蛋白,可溶性的肌肉蛋白及肌肉特异性的转录因子等,这些所有的肌源蛋白的产生都经过了复杂的肌肉发生与分化过程.基于相关研究近况,分析了多种转录因子的正、负向调控对肌肉分化发育的影响,同时讨论了研究此调控过程的理论价值及未来应用意义.     

肌肉增强子因子2对猪肌肉生长抑制素启动子活性的调节

肌肉生长抑制素(Myostatin,Mstn)是转化生长因子-β超家族的成员,在哺乳动物的骨骼肌生长和分化过程中起负调控作用,其转录调控受到多个基因的影响,其中肌肉增强子因子2(MEF2)是重要的调控因子之一。因此,对猪Mstn启动子上MEF2位点及其作用方式的探讨具有重要意义。首先,通过PCR方法扩增了猪Mstn基因上游1 969 kb的启动子序列,利用生物信息学方法分析该序列包含3个MEF2的结合位点;其次,采用逐步删除的方法获得5个长度不等的启动子,用荧光素酶报告系统评估了它们在小鼠成肌细胞C2C12中的活性。其次,转入含有MEF2结合位点的启动子片段和MEF2C表达载体,可以显著增强启动子活性2～6倍,高表达另一亚型MEF2A则启动子活性没有明显改变。最后,转入MEF2C表达载体,用实时定量PCR和Western blotting方法检测Mstn的转录和蛋白水平的变化,结果发现mRNA升高了2～4倍;在肌管细胞中,蛋白翻译水平也有显著升高。这些结果显示,MEF2C可以通过激活Mstn参与猪肌肉生长和发育阶段的调节。研究为Mstn基因的转录调控提供了有效的作用靶点和效应分子,为进一步探讨Mstn的功能调控提供了一种新的思路。     

人与小鼠核糖体蛋白基因内含子中的转录调控位点分析

前期对酵母和果蝇核糖体蛋白(Ribosomal protein, RP)基因内含子序列中的寡核苷酸分析表明, 内含子中含有潜在的转录因子结合位点。为进一步发掘核糖体蛋白基因内含子参与转录调控的证据, 文章首先基于频率分析方法抽提出人和小鼠核糖体蛋白基因第一内含子中高频(Over-represented)出现的寡核苷酸片段 (亦称模体, Motif), 这些寡核苷酸中超过85%与已知的转录因子结合位点吻合, 是潜在的转录调控元件。对抽提出的寡核苷酸进行碱基组成分析, 发现95%以上的寡核苷酸富含碱基C和G, 而较少富含A和T。从寡核苷酸在内含子中的分布情况看, 它们相对靠近第一内含子的5′端, 即距离基因转录起始位点和上游区域较近。推测这些特征可能与基因转录调控有关。     

肌生成抑制素的结构、功能和应用前景

肌生成抑制素是1997年发现的骨骼肌生长发育负调控因子,肌生成抑制素基因缺失鼠肌肉增大,骨骼肌肌群分布更广泛,基因缺失鼠体重较野生鼠大2～3倍。进一步研究表明,肌生成抑制素具有多种生物学功能。     

猪精浆蛋白基因PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ启动子序列克隆及生物信息学分析

分别用PCR方法扩增了1.7kbp和1.6kbp的猪PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因的启动子,并进行TA克隆,测序鉴定,测序结果用DNAstar程序与Genebank中的相应序列进行对比分析,结果显示与已发表序列的同源性分别为99.8%和96.3%。利用生物信息学的方法对克隆的1.7kbp和1.6kbp的猪PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因的启动子区进行了预测分析。PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ基因序列对比(mVista)分析发现,启动子0→-1000bp的保守性较高,其中0→-200bp核心启动子部分的序列同源性达到了100%,而-1000bp上游序列的保守性则较低。启动子的位置预测(Promoter Scan)结果显示,转录起始点上游200bp的区域为两基因的核心启动子位置。启动子区转录因子结合位点预测(TFSEARCH)发现,转录起始位点上游的1000bp区域内含有大量的顺式调控元件,并且得到了一系列潜在的转录因子结合位点。     

猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC2）基因出发,在dbEST数据库中进行同源性搜索,找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证,获得猪TNNC2基因全长cDNA序列,其全长843bp,开放阅读框为201～683bp,编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明,与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93.6％、90.5％,蛋白序列同源性均为97.5%。多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在骨骼肌中表达,并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。     

进行性肌营养不良患者Myo

进行性肌营养不良是一组以进行性骨骼肌萎缩和无力为特征的肌源性肌病.肌肉抑制素(Myostatin)是最近发现的骨骼肌生长发育抑制因子.为探讨Myostatin基因与进行性肌营养不良病理发生的相关性,采用RT-PCR方法克隆了患者的Myostatin基因并测序、分析肌营养不良患者是否存在Myostatin基因突变;然后采用半定量RT-PCR方法检测患者中Myostatin基因的表达水平是否发生改变,同时用Western blot方法分析了肌营养不良患者中Myostatin蛋白的表达情况.结果发现,所研究的肌营养不良患者中没有携带Myostatin基因突变,但一些患者的Myostatin基因转录水平降低,部分患者Myostatin蛋白加工障碍.结果提示,一些类型(亚型)的进行性肌营养不良可能与肌肉抑制素Myostatin基因表达异常、蛋白加工障碍有关.     

Krüppel样因子在肌肉组织中的功能研究进展

Krüppel样因子(Krüppel-like factors, KLFs)是一类C-末端含有3个C₂H₂锌指结构的转录因子,N-末端为转录调控结构域,能够结合多种特异蛋白质,介导转录调控。目前在人体基因组中共发现18种KLFs,它们在多种类型人类细胞的分化、表型维持和生理功能调控中发挥重要作用。多个KLFs参与了对人和动物的心肌、平滑肌和骨骼肌的发育和功能的调控。在心肌中,KLF4、KLF10、KLF11和KLF15参与心肌肥大的负调控,KLF6参与调控心脏纤维化,KLF13调控胚胎时期的心肌发育。在血管平滑肌中,KLF4受促增殖或促分化因子调控,介导调控血管平滑肌表型转换;KLF5促进血管平滑肌增殖,KLF8和KLF15抑制血管平滑肌增殖。在骨骼肌中,KLF2、KLF3、KLF4、KLF10和KLF15调控骨骼肌发育,此外,KLF15是肌肉组织能量代谢的调节因子。本文综述了KLFs在心肌、平滑肌和骨骼肌中的功能研究进展,为进一步揭示KLFs在肌肉组织中的作用和肌肉相关疾病的分子机制提供参考。     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

组织器官通讯对骨骼肌发育的作用及调控机制研究进展

骨骼肌是动物机体最重要的器官之一,研究骨骼肌发育调控机制对于肌肉相关疾病的诊断以及家畜肉质的改善都有着重要意义。骨骼肌发育调控是一个复杂的过程,受到大量肌肉分泌因子和信号通路的调节。此外,为了维持体内代谢稳态并最大限度地利用能量,机体协调多个组织器官形成了复杂而又精密的代谢调控网络,对于调控骨骼肌发育也发挥着重要的作用。随着组学技术的发展,人们对于组织器官通讯的潜在机制进行了深入研究。本文综述了脂肪组织、神经组织、肠道等组织器官通讯对于骨骼肌发育的影响,以期为靶向调控骨骼肌发育提供理论基础。     

Mstn基因干扰通过上调基因Cpt1b促进肌间脂肪的β氧化

肌生长抑制素(myostatin,Mstn)也被称为生长/分化因子-8(GDF-8)。敲减或敲除Mstn基因可促进肌肉发育、降低脂肪含量。本研究利用RNA干扰技术制备Mstn干扰小鼠,随后对其骨骼肌形态、骨骼肌甘油三酯(triglyceride,TG)含量、脂肪酸组成及含量进行了分析。结果显示,与对照组相比,Mstn干扰小鼠肌肉中Mstn的表达减少。小鼠骨骼肌肌纤维的横截面积显著增大,而TG含量显著降低,n-3/n-6和不饱和/饱和脂肪酸比值显著升高。通过实时荧光定量PCR检测脂肪酸代谢相关基因的表达,结果表明脂肪酸分解和转运相关基因表达上调,而脂肪酸合成相关基因表达下调。在这些基因中,与β氧化相关的基因Cpt1b的上调尤为明显。对骨骼肌中CPT1的酶活性进行了检测,结果与基因表达情况一致。为探讨其进一步作用机理,通过染色质免疫沉淀实验发现,Mstn基因下游转录因子SMAD3可与Cpt1b基因的启动子直接结合。上述结果表明,Mstn敲减后主要通过调控其下游转录因子SMAD3与Cpt1b基因启动子的结合,上调Cpt1b的表达,从而促进肌内脂肪酸的β氧化代谢。