电泳滴定曲线及其应用

电泳滴定曲线法是一种双向电泳法,第一向等电聚焦,以获得固定的pH梯度;然后加样,进行第二向电泳,得到的电泳滴定曲线图,直接反映了在各种pH下,各蛋白质组分之间在迁移率上的差异。该法在选择蛋白质分离纯化的最佳条件;研究蛋白质的突变;研究分子间相互作用等领域,已表现出广阔的应用前景。     

应用电泳滴定曲线预测离子交换层析法的最佳pH条件

电泳滴定曲线(Electrophoretic TitrationCurve,ETC)是近年引人注目的一项新技术.它组合等电聚焦-电泳技术进行制备,即在含有两性电解质的聚丙烯酰胺(PAA)胶板上,经预聚焦形成pH梯度后,胶板转90度再经一次电泳,使样品蛋白质按其表面电荷的性质和密度在pH梯度中迁移泳动形成ETC. ETC的分辨力高,可用于蛋白质的纯度检测,包括单一氨基酸或蛋白质突变体;用于蛋白质表面电荷特性和等电点的检测;用于选择各     

应用电泳滴定曲线预测离子交换层析法的最佳pH条件

电泳滴定曲线(Electrophoretic Titration Curve,ETC)是近年引人注目的一项新技术。它组合等电聚焦-电泳技术进行制备,即在含有两性电解质的聚丙烯酰胺(PAA)胶板上,经预聚焦形成pH梯度后,胶板转90度再经一次电泳,使样品蛋白质按其表面电荷的性质和密度在pH梯度中迁移泳动形成ETC。 ETC的分辨力高,可用于蛋白质的纯度检测,包括单一氨基酸或蛋白质突变体;用于蛋白质表面电荷特性和等电点的检测;用于选择各     

用自制的GFP血清抗体做免疫印迹

介绍如何用自制的GFP血清抗体为本科生开展免疫印迹实验。实验包括大肠杆菌表达的GFP的超声破碎抽提、GFP的非变性PAGE制备电泳和SDS-PAGE制备电泳、GFP血清抗体的快速亲和纯化及最后的免疫印迹分析等实验组成的完整系列。学生通过本实验的训练在蛋白质免疫印迹的操作上有明显的进步。     

蜜蜂血淋巴蛋白质的淀粉胶电泳

凝胶电泳是区域电泳的一种,系利用凝胶(如琼脂、淀粉及多聚丙烯酰腈胺凝胶)作为电泳的支持物。1955年smithics首先应用淀粉胶电泳来分离人血清蛋自质。一系列的工作证明这种电泳法具有分辨力高、泳动区带清晰等优点。作者等曾采用该方法研究了家蚕Bombyx mori和蓖麻蚕Attacus cynthia rinici发育过程中血淋巴蛋白质成分的变化,发现随龄期的增长,其蛋白成分也相应增加。对于蜜蜂血淋巴生化成分的分析,尤其蛋白质、氨基酸和糖类等的研究近年来已日益受到重视。本实验应用淀粉胶电泳法研究了蜜蜂Apis millefera血淋巴蛋白质的胶电泳特性。 材料和方法 淀粉肢电泳包括有淀粉的部分水解、制胶、血淋巴     

染料配基吸附层析纯化血清白蛋白

将染料分子偶联于交联琼脂糖凝胶上制成蓝色、红色和黄色等五种层析介质进行血清白蛋白分离的研究。比较了五种染料配基的吸附性能,考察了温度、pH值、蛋白质浓度和无机盐浓度对吸附血清白蛋白的影响。选择了合适的分离条件。从产妇分娩血中用染料配基吸附层析提取了人血清白蛋白(HAS)。一步分离达到电泳纯,回收率为95％,优于传统的盐析工艺。     

’93国际电泳学术会议在挪威召开

’93国际电泳学术会议(International Council ofElectrophoresis Societies,ICES-ELPHO 93)于1993年6月1日至4日在挪威美丽迷人的海滨小城 Sandefjord举行.我作为唯一的中国代表(由瑞典 Pharmacia LKB公司资助)参加了会议.参加会议的共有200多人.大多来自欧洲各国,其次是美国和日本.世界上著名的电泳权威都出席了会议.会议的第一天有四个专题学习班可任意选择参加.这四个专题是:“用固相 pH 梯度等电聚焦作为第一向的双向电泳”,“毛细管电泳”,“使用琼脂糖凝胶的滴定曲线技术和快速转移”,“电泳谱带的图像分析”.学习班介绍的内容都是当前电泳的前沿技术,在学习班上每个学员都可以进行操作练习.会议有八个专题报告:     

酵母表达重组人血清白蛋白检测方法的比较

应用生化法、电泳扫描结合Bradford法、竞争ELISA等3种方法检测酵母表达重组人血清白蛋白(rHSA)的表达量。结果表明,3种方法检测结果近似。比较而言,生化法灵敏度较低,但操作简便,价格低廉;竞争ELISA法灵敏度最高,但需要特异的抗体;电泳扫描结合Bradford法需要特殊仪器,操作繁琐,花费时间长,灵敏度介于生化法和竞争ELISA法之间。综合利弊,生化法可作为检测酵母表达rHSA的首选方法,如条件允许,可考虑采用电泳扫描结合Bradford法或竞争EUSA。     

多种血清小分子蛋白分离提纯方法比较研究

目的:比较不同磁珠及超滤离心管时血清小分子蛋白的分离提纯能力,筛选较优的分离提纯方法.方法:分别利用Cu2+螯合磁珠(MB-IMAC Cu)、弱阳离子磁珠(MB-WCX)、反相C18磁珠(MB-RPC18)及3种不同型号的超滤离心管对同样4例血清标本进行血清小分子蛋白的分离提纯,比较6种方法对血清高丰度大蛋白的去除能力和处理后血清小分子蛋白质谱图的质量.结果:6种不同的方法均有明显对血清高丰度蛋白的去除能力,其中以超滤离心管效果最明显.在血清小分子蛋白质谱图质量上,磁珠处理后血清生成的质谱图质量更好,其中MB.WCX处理后血清质谱图中总峰数量最多,且在各分子量范围均分布均匀,适于后期鉴定.结论:利用MB.WCX对原始血清进行分离提纯能够获得质量较好的血清小分子蛋白质谱图,可以为进一步实验中寻找差异小分子蛋白并实现兴趣蛋白鉴定奠定良好基础.     

人肺鳞癌组织的血清蛋白质组学的比较分析

采用以肿瘤免疫学与蛋白质组学(proteomics)研究技术有机地结合为基础的血清蛋白质组学研究体系(serologicproteomeanalysis ,SERPA)筛选肺癌分子标志物.对10例人肺鳞癌组织,应用双向凝胶电泳(two dimensionalelectrophoresis ,2 DE)技术对同一肺鳞癌组织的细胞总蛋白同时进行电泳后获得3张相同的凝胶,其中一块2 DE凝胶经银染显色作为平行胶,其余两块2 DE凝胶经电转膜将凝胶中的蛋白质转至硝酸纤维素(NC)膜上,然后分别与肺癌患者的自身血清以及正常对照血清进行Western印迹分析,获取Western印迹反应图谱.经计算机图像分析识别差异反应的蛋白质,然后与平行胶比较找出相应的差异反应蛋白质点.获得了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常对照血清的Western印迹反应图谱;图像分析共识别36±8个差异反应的蛋白质;在平行胶上找到了匹配的差异反应蛋白质点.对2 0个差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析,鉴定出14个与细胞生长增殖、细胞代谢、细胞周期调控、信号转导等有关的肺鳞癌相关抗原.通过血清蛋白质组技术对肺鳞癌组织进行的研究,建立了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常血清的Western印迹反应图谱,成功鉴定14个肺鳞癌相关抗原,为进一步筛选用于肺鳞癌诊断、治疗和预后评估     

卷柏总蛋白质提取方法及双向电泳条件的建立

目的:建立复苏植物——卷柏总蛋白质的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行阵列分离的双向电泳条件。方法:通过多种条件的组合与优化,建立了以物理和化学2种方法充分裂解植物组织细胞,并采用低温操作、加入PVP等去除植物组织中大量的酚类物质,最后离心去除不溶性杂质的卷柏蛋白质组双向电泳(2-DE)样品制备方法。第1向电泳为固相pH梯度等电聚焦,第2向电泳为垂直平板SDS-PAGE。结果:通过对样品制备、蛋白定量、第1向和第2向电泳、染色方法等各实验环节进行控制和优化,凝胶经考马斯亮蓝染色后,可分辨蛋白质斑点数约600个。结论:建立了卷柏总蛋白质的提取方法及蛋白质组双向电泳技术,为后续研究卷柏在干旱胁迫下的差异表达奠定了基础。     

一种具有抑制糜蛋白酶活性的血清DNA结合蛋白质的纯化和理化特性

 本文采用离子交换层析,DNA亲和层析和硫酸铵盐析三步从人血清中分离纯化了一种肿瘤相关DNA结合蛋白质(64DP)。本方法较简便,产率提高。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫电泳鉴定纯度符合要求。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为64,000。等电聚焦电泳测得等电点在4.2左右。醋酸纤维膜电泳和转移电泳表明其为一种α_1球蛋白。过碘酸西夫氏糖蛋白染色呈阳性反应。氨基酸分析和酶抑制试验证实64DP与α_1抗縻蛋白酶很相似。     

人C-反应蛋白的等电点的测定

人C-反应蛋白(CRP)等电点的最早报道为1954年Wood等用自由电泳法测定为今4.82。我们在1983年用等电聚焦法测定为5.2,但在PH4.7及6.6处亦有两条区带。后来看到Laurent等用滴定曲线法测CRP的pI为6.3±0.2,但在pH7.2-8.5间;4.0-5.0间亦有其等电点区,后者可能为酸变性CRP的等电点。我们也用此法测定自制的并纯化了的CRP等电点,所得曲线与报道相似,但由于滴定曲线与样品槽在比较宽的pH范围内均非常接近,交点(即等电点)不易读出,因而我们改用了聚焦-免疫双向电泳法,得到比较满意的结果。测得人CRP的等电点为5.7-6.0,在pH7.2-8.5或4.0-5.0间,均无区带出现。     

测定冠心病患者血清HDL-C和LDL-C水平的方法学比较

目的:比较超速离心法、电泳法、匀相法、沉淀法在干扰因素存在时检测冠心病(CHD)患者血清胆固醇水平的特异性。方法:采用超速离心法、电泳法、匀相法及沉淀法对150例CHD患者和102例健康体检者分别进行血清胆固醇水平的测定,比较各方法之间的相关性,同时分析导致结果差异的因素。结果:四种方法检测健康人群HDL-C、LDL-C水平,结果间无统计学差异(P>0.05);CHD组,当TG≤2.26mmol/L时,采用沉淀法和匀相法检测CHD患者血清LDL-C,结果差异较小(P>0.05),电泳法检测结果偏高,与沉淀法、电泳法间有统计学差异(P<0.05)。超速离心法与电泳法间的相关性良好,但匀相法及沉淀法易受高胆红素、高血红蛋白等因素的影响。结论:超速离心法虽耗时、价格贵,但仍为检测HDL-C、LDL-C的经典方法,电泳法受高胆红素、血红蛋白、高三酰甘油等干扰因素的影响相对较小,适用于冠心病HE合并高血脂血清HDL-C、LDL-C水平检测。     

箭毒木种子蛋白质样品制备及双向电泳改良方法

建立箭毒木（Antiaris toxicaria）种子总蛋白的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行分析的双向电泳条件。通过各种条件的优化与组合,建立了以TCA-丙酮为基础的Tris—HCl提取法提取总蛋白,第1向电泳为固相pH梯度等电聚焦,第2向电泳为垂直平板SDS-PAGE的双向电泳体系。通过对样品制备、样品溶解、等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及染色方法等关键步骤进行分析,获得了满意的双向电泳图谱。在探索适合箭毒木种子蛋白质组学研究双向电泳方法中,比较了三氯乙酸-丙酮沉淀法、和Tris—HCl法,以及对双向电泳过程中的关键步骤的改良,认为Tris—HCl法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大,为箭毒木属植物的差异蛋白质组学的后续研究打下了坚实的基础。     

毛细管电泳电化学免疫分析法检测人血清乙肝表面抗原

目的:建立用于测定人血清中乙肝表面抗原的毛细管电泳电化学免疫技术.方法:以微量滴定板为固相载体,预包被上乙肝表面抗体(抗-HBs),与血清乙肝表面抗原(HBsAg)及活化钌标记的乙肝表面抗体之间发生特异性免疫反应,形成三明治结构,将此双抗夹心免疫复合物进行毛细管电泳电化学分析.结果:利用此方法测定人乙肝表面抗原含量,浓度在0.08ng/mL～10 ng/mL范围内与峰电流呈良好的线性关系,线性回归方程为y=0.2840x+0.9535,检出限为0.01 ng/mL(3σ).结论:该法可以实现低浓度乙肝表面抗原血清样本低廉、快速、简便、定量检测.     

山黧豆叶片蛋白质双向电泳技术的建立

以山黧豆叶片为材料,比较分析了蛋白质的不同提取方法,在此基础上着重于样品制备。对IPG胶条的选择,第一向等电聚焦和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳程序及参数、染色方法等相关技术进行了比较和条件优化。结果显示：采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白质,裂解液中加入Tris-base作为蛋白酶抑制剂,等电聚焦电泳时延长低电压的电泳时间（30V、12h,500V、1h,1000V、2h）以促进盐离子泳出的方法对山黧豆叶片蛋白质进行双向电泳,并用考马斯亮蓝和银染复合染色法进行凝胶染色,能够获得蛋白点清晰的双向电泳图谱,说明用优化后的方法建立起的山黧豆叶片蛋白质双向电泳技术,蛋白质样品制备质量好,电泳分辨率高,完全适合于进一步的蛋白质组学研究。     

ELISA检测肿瘤患者血清64DP

据报道64DP是一种与肿瘤相关的人血清DNA结合蛋白质,其现有的定量测定方法略嫌繁琐粗糙。本文采用亲和层析法纯化的兔抗64DP抗体,建立了简便灵敏的酶免疫测定法(ELISA)。部分样本经ELISA和火箭电泳两种方法平行测定,证明两者有良好的相关性。对70例恶性肿瘤及86例正常对照血清的测定结果,肿瘤组平均64DP水平显著高于对照组,其中尤以肝癌、胃癌及肺癌的增高更为显著。对非肿瘤其它疾病患者的检测发现感染和外伤也能造成血清64DP的迅速增加。本研究表明血清64DP的改变不仅仅局限于恶性肿瘤,它具有急性期反应蛋白质的特征。这使64DP作为肿瘤标志物应用于临床受到一定限制。     

对角线电泳的一些应用

作为鉴定物质的一种方法,电泳在生物化学和医学临床等领域有着广泛应用。特别是区带电泳由于设备简单、操作方便等优点,已成为开展生物化学和分子生物学等研究工作的一种不可缺少的工具。在蛋白质的研究中应用最广泛的是聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。由于电泳是生物化学的一项基本技术,对于其基本原理、分类、操作等内容不再赘述。近来由于生命科学各门学科向分子生物学方向的发展,对蛋白质的研究更加深入,而聚丙烯酰胺电泳这一经典技术也有了新的应用,特别是对角线电泳的应用进展更快。对角线电泳是双向电泳的一种特例。双向电泳将蛋白质样…     

蛋白质检测的方法学研究概述

蛋白质作为生命活动中起重要作用的生物大分子,与一切揭开生命奥秘的重大研究课题都有密切的关系.蛋白质的分离与检测是蛋白质研究的主要技术之一.我们就蛋白质检测的常规方法、电化学检测方法、分子生物学检测方法、电泳法和质谱法等进行了简要综述.