低乙醛Lager型啤酒酵母研究进展

啤酒酵母是啤酒酿造的核心,对啤酒风味及风味稳定性具有重要影响。乙醛是影响啤酒风味和风味稳定性最重要的醛类化合物,是酒精饮料中引起人类致癌的物质之一,主要通过啤酒酵母的生物代谢产生,存在于啤酒发酵过程及成品啤酒中。因此,筛选或选育优良的低产乙醛啤酒酵母菌株将成为有效解决啤酒风味稳定性的途径之一。近年来,随着基因工程技术的发展及啤酒酵母基因组的不断阐明,人们对啤酒酵母菌种改良展开了大量的研究,以期解决啤酒酿造问题,改善啤酒质量。本文对采用传统方式及基因工程手段选育低产乙醛啤酒酵母的最新研究进展进行了综述。其中,对低乙醛啤酒酵母选育的手段及策略进行了讨论并对低乙醛啤酒酵母选育的研究热点及发展趋势进行了展望。     

枯草芽孢杆菌α乙酰乳酸脱羧酶基因在啤酒酵母工业菌株中的表达

啤酒酿造中,双乙酰是影响啤酒生产熟化期长短及其风味的主要因素.存在于多种细菌中的a-乙酰乳酸脱羧酶(EC4.1.1.5,简称a-ALDC)[1]能将双乙酰的前体a-乙酰乳酸直接转化为对啤酒风味没有影响的乙偶姻,从而大大降低啤酒中双乙酰的含量,缩短啤酒熟化期.但所有的啤酒酵母菌不产生此酶.虽然在发酵过程中添加此酶是一个解决的途径,但解决问题的根本是将ALDC基因引入到啤酒酵母菌中.国外已开展这方面的研究[2,3],本研究组曾用随机克隆的方法获得了枯草芽孢杆菌a-ALDC基因[4],本文报道了枯草芽孢杆菌ALDC基因在工业用啤酒酵母中的表达研究结果.     

几株啤酒酵母的筛选及发酵性能比较*

啤酒酵母是啤酒酿造的灵魂,可以直接影响啤酒品质。在啤酒酿造过程中,由于啤酒酵母被多次传代和保藏,造成优良菌种发酵性能衰退等问题,导致发酵不彻底,影响最后啤酒的风味质量。为此以8株Lager型啤酒酵母为出发菌株,通过平板分离纯化获得80株分离菌株,再经过三角瓶发酵初筛和复筛、发酵罐中试发酵实验最终获得了8株发酵性能优良的啤酒酵母。其中,6株酵母可应用于酿造双乙酰含量低于0.1 mg/L的啤酒;3株酵母发酵度高于70%,适合酿造干啤酒;1株酵母发酵度低于50%,适合酿造低醇啤酒。在风味方面:1株酵母酿造的啤酒醇酯比为3.3,啤酒酯香味较突出;另1株酵母酿造的啤酒醇酯比为4.5,啤酒高级醇含量较高。8株经过选育的啤酒酵母发酵特征明显,便于精酿啤酒厂实际应用。     

Lager啤酒酵母RLM1基因调控对其抗自溶性能的影响

啤酒酵母的自溶会严重影响啤酒的品质,而酵母的质量也被认为是啤酒酿造的关键因素之一。前期在啤酒酵母自溶的研究中发现细胞完整性途径中重要的转录因子RLM1基因与酵母自溶有密切关系。本研究在啤酒酵母单倍体菌株中对RLM1进行敲除与过表达,发现RLM1敲除后,酵母菌抗自溶性能差,而RLM1过表达则有助于酵母的抗自溶。另外,发现RLM1基因的敲除影响了酵母的抗渗透压性能、细胞壁损伤的耐受性、抗氮饥饿性能和温度耐受性。研究发现细胞壁组装及DNA损伤应答相关基因GAS1的表达随RLM1的过表达与敲除而调整,而CWI途径中其他相关基因的调控方式并没有明显的规律,推测RLM1可能主要影响了CWI途径中GAS1基因的表达,进而提高啤酒酵母在恶劣环境中的抗逆性。此研究结果对于进一步选育抗自溶啤酒酵母以及了解啤酒酵母的自溶机制提供了基础。     

啤酒酵母代谢工程研究进展

啤酒工业上应用的啤酒酵母菌株在生产中都会存在着某些方面的缺陷。通过分析啤酒酵母某些代谢产物的代谢途径,寻找改变其代谢流量的方法,然后用分子生物学手段对其代谢流量加以改变,来调节啤酒酵母某些产物的代谢水平已经成为啤酒酵母育种的新方式。对酵母的底物利用、可操作性、控制有害副产物的产量及改善啤酒风味等方面的研究成果进行了综述。     

拉格啤酒酵母菌物种和株系的快速分子鉴定

近年来的基因组学研究结果已证实拉格啤酒酵母Saccharomyces pastorianus是一个由艾尔啤酒酵母S. cerevisiae和真贝氏酿酒酵母S. eubayanus杂交而成的杂交种,并可根据地域传承和染色体倍性分为两个株系,即I型/Saaz系和II型/Frohberg系。前者主要为异源3倍体,后者则主要为异源4倍体。为了探讨中国啤酒酿造酵母菌的物种和菌系归属,我们根据拉格啤酒酵母及其两个菌系的基因组特性,制定了一套基于IntFR片段种特异性扩增和ITS-RFLP分析的精确但简便易行的拉格啤酒酵母菌物种和株系鉴定新方法,并以酿酒酵母属内相关种的模式或权威菌株和部分酒精及面包酵母为参照,对保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）的41株啤酒酿造酵母菌进行了重新鉴定和分型。这些菌株除1株原定名为贝氏酿酒酵母S. bayanus外,其余菌株的原定名均为S. cerevisiae。研究结果确认了S. bayanus菌株鉴定的正确性,但在其余的40株啤酒酵母菌株中,21株属于S. cerevisiae,1株属于葡萄汁酿酒酵母S. uvarum,18株属于S. pastorianus。菌系鉴定和流式细胞测定结果显示在确认的S. pastorianus菌株中,1株为I型/Saaz系,3倍体;17株为II型/Frohberg系,其中9株为4倍体,两株为3倍体,5株介于3倍至4倍体之间。啤酒酵母物种和株系的确认对优化发酵工艺和菌种选育及遗传改造等具有重要意义。     

走出青藏高原：拉格啤酒酵母的起源与演化

采用低温底层发酵的拉格(lager)啤酒15世纪开始在德国巴伐利亚地区出现,19世纪初流行至全世界,目前已成为全球产量最高的酒精饮料。目前已阐明,拉格啤酒发酵酵母为巴斯德酿酒酵母(Saccharomyces pastorianus),该种是一个杂交种,由艾尔(ale)啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)与野生真贝氏酿酒酵母(Saccharomyces eubayanus)杂交而成,后者赋予了拉格啤酒酵母的耐低温能力。近年的群体遗传学和群体基因组学研究表明,拉格啤酒酵母的野生亲本S. eubayanus起源于青藏高原,可能通过丝绸之路传播到了欧洲。比较基因组学研究表明,拉格啤酒酵母包含2个株系,即Ⅰ系/Saaz系和Ⅱ系/Frohberg系,早期分别流行于中欧和西欧地区。前者为近似异源3倍体,后者为近似异源4倍体。2个株系在耐低温、麦芽三糖利用和风味物质产生能力等方面具有明显差异。在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)保藏的S. pastorianus菌株绝大多数属于Ⅱ系/Frohberg系。野生S. eubayanus的发现为通过人工杂交创建新的啤酒酵母杂交菌株,从而为选育具有独特发酵性能的新型非转基因啤酒酵母菌株提供了新途径,可能会对啤酒酿造的未来产生重大影响。本文除简要介绍啤酒酵母的研究历史外,重点阐述近年来在拉格啤酒酵母的杂种特性、起源、演化和基因组构成等方面的最新研究进展,并指出需要进一步解决的问题和未来研究趋势。     

RIM21基因缺失对拉格啤酒酵母絮凝性能的影响

拉格啤酒酵母是我国啤酒酿造的主要菌种。细胞絮凝是啤酒酵母重要的生产性状,在不影响发酵性能的情况下适度提高酵母的絮凝能力,有助于发酵结束时细胞和产物的分离,有利于工业化啤酒生产,具有较高的经济价值。前期在对一株工业用拉格啤酒酵母G03及其絮凝突变株的研究中,挖掘到一个可能影响啤酒酵母絮凝性的候选基因RIM21。为了验证该基因的作用,文中在G03中对RIM21进行了敲除,发现RIM21敲除后,酵母在11 ℃发酵条件下的絮凝性能增强,基因FLO5、Lg-FLO1及细胞壁完整性途径中的部分基因表达上调。同时,CO2失重、酒精度、发酵度等发酵指标未有明显变化。另外,发现RIM21的缺失增强了啤酒酵母对细胞壁抑制剂的耐性。研究结果为阐释低温发酵条件下啤酒酵母的絮凝调控机理及菌株絮凝性的改善提供了基础。     

产香酵母Pichia myanmarensis LX15的分离纯化及对精酿啤酒风味物质形成的影响

为了适应精酿啤酒对个性化风味的需求,能产生特定风味化合物的产香酵母成为研究者的研究重点。从精酿啤酒原液中分离到1株产香酵母LX15菌,该菌细胞呈圆形或卵圆形、多极芽殖生长;LX15菌在玉米粉培养基上培养7~10 d不形成假菌丝,在酵母膏蛋白胨培养基上培养3 d能够形成子囊孢子。经生理生化特征和系统发育分析,确认该生香酵母为Pichia myanmarensis菌中的一个菌株,所产主要风味化合物包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯。当LX15菌与啤酒酵母C1菌共发酵时,能够产生协同效应,提高酯类化合物和高级醇类的含量,并与LX15菌的接种比例正相关,但并不影响啤酒酿造的整体发酵速率和发酵能力。因此,LX15菌是一株适于提高精酿啤酒风味的产香酵母菌。     

啤酒酵母ECM25/YJL201W基因敲除对啤酒风味稳定性的影响

以pUG6为模板, 设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物, 构建了带有卡那抗性基因(kanMX)破坏盒, 转化啤酒酵母G-03, 获得一株G-03/a转化菌, 遗传稳定性良好, 测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。有氧条件下11oC和28oC培养时转化菌G-03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)分泌量在对数生长期分别比原菌高21.4%和14.7%。在锥形瓶中连续发酵4代后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液、成品酒中GSH含量分别提高32.1%和13.8%, 发酵液和成品啤酒SI系数分别提高7.7%和5.3%, 成品啤酒RSV值提高45.0%。EBC管发酵6 d后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液中GSH含量提高34.0%。转化菌G-03/a与G-03所酿制成品啤酒的常规指标没有显著差别。表明G-03/a是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母, 能够提高啤酒的风味稳定性。     

SSU1多拷贝表达对酿酒酵母二氧化硫生成量的影响

【目的】在不影响酵母正常代谢前提下,构建亚硫酸盐分泌量提高的基因工程菌株,增加二氧化硫生成量,有效地解决啤酒老化问题。【方法】以适量高产二氧化硫工业啤酒酵母突变株M8总DNA为模板,PCR方法得到带有不同长度5′端非编码区的基因片段SSU1-1、SSU1-2,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352构建表达载体pSU1和pSU2,转化实验室酵母YS58,验证SSU1多克隆表达对其二氧化硫生成量的影响。进而将pSU2转化工业啤酒酵母M8,利用亚硫酸盐抗性筛选转化子,并对其二氧化硫和硫化氢生成量及其啤酒抗老化性能进行测定和分析。【结果】实验室酵母转化子pSU1-4和pSU2-3二氧化硫生成量较原株明显提高而硫化氢生成量基本不变,工业啤酒酵母转化子Y2二氧化硫生成量比原株M8提高74.4%,TBA值下降14.9%,DPPH自由基清除率提高38.2%,硫化氢生成量基本不变。【结论】SSU1基因的多拷贝表达有效提高了亚硫酸盐转运蛋白Ssu1p表达量,增加了亚硫酸盐分泌量,啤酒抗氧化能力得到明显增强,而对酵母硫代谢途径中亚硫酸盐还原为硫化物代谢过程没有影响。     

浅谈酿造用水对啤酒酿造的影响

啤酒作为人们生活餐桌、节日庆典、朋友聚会的必备饮品之一,已经成为我们生活中饮品的一部分。啤酒中大部分成分是水,水的质量直接影响啤酒的品质和风味,世界许多知名啤酒生产企业对啤酒酿造用水都有严格的要求,因此,啤酒酿造用水也被业内人士成为"啤酒的血液"。本文从啤酒酿造用水选取入手,来探究啤酒酿造用水对啤酒酿造的影响。     

全小麦啤酒酵母菌株的诱变育种及应用研究

采用10 Kev低能N~+注入啤酒酵母,经筛选获得一菌株Lz37,再用150 MPa超高压处理菌株Lz37,经双乙酰平板筛选获得一菌株Gy3,其凝聚性很强,适合于在小麦汁中发酵啤酒,其发酵度为66%～68%,双乙酰含量低于口味阈值,遗传稳定性良好。将Gy3酵母定为全小麦啤酒生产应用酵母,命名为商啤3号(Sp-03)。SP-03啤酒酵母菌株的各项生理及生产性能都较优良,特别是在全小麦芽啤酒的酿造中适用性较强,经过对发酵工艺等的调整,用其酿制的啤酒口感纯正、淡爽、柔和。     

异柠檬酸脱氢酶基因调控对拉格酵母抗自溶性能的影响

啤酒酵母的自溶会影响啤酒的风味和品质,对酵母自溶的调控是工业啤酒生产的迫切需求。前期在啤酒酵母自溶的研究中发现柠檬酸循环相关基因对酵母自溶有较大影响。为探究柠檬酸循环中异柠檬酸脱氢酶基因调控对自溶的影响,在典型拉格啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus H.)Pilsner中对IDP1和IDP2基因进行了破坏和过表达。结果发现IDP1基因的破坏能提高酵母的抗自溶能力,自溶96 h抗自溶指数为8.40,比原始菌提高了1.5倍。IDP1基因的破坏提高还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的供应,NADPH/NADP^(+)的比值为1.94,发酵结束时胞内ATP水平比原始菌提高1.8倍,活性氧(reactive oxygen species,ROS)相比原始菌减少10%。IDP2基因的缺失造成酵母快速自溶和NADPH供应的减少,自溶96 h抗自溶指数为4.03,NADPH/NADP^(+)的比值为0.89。发酵结束时胞内ATP水平相比原始菌减少8%,ROS是原始菌的1.3倍。本研究进一步阐释了柠檬酸循环相关基因对酵母自溶的调控机理,为选育自溶性能可控的优良酵母提供了理论基础。     

啤酒生产中双乙酰形成的分子遗传学及其控制

双乙酰是啤酒中的重要风味物质,也是影响啤酒成熟和质量的关键因素之一。双乙酰是由酵母缬氨酸生物合成的中间产物α－乙酰乳酸经氧化脱羧产生的。目前,可以通过改良传统发酵工艺,添加酶制剂以及利用基因工程手段选育酵母工程菌等方法降低双乙酰在啤酒中的含量,缩短啤酒后酵期,以加速啤酒成熟。     

构建高产谷胱甘肽啤酒酵母基因工程菌提高啤酒抗老化能力的研究

根据同源重组的原理,将来源于啤酒酵母工业菌株G03的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)和筛选标记Kan取代质粒pRJ-5中18S rDNA内部约340bp的DNA片段,构建重组质粒pRKG。以pRKG为模版,PCR得到以18S rDNA为整合位点包含GSH1和Kan的基因片段18S rDNA::(Kan-GSH1)。用此片段转化啤酒酵母工业菌株G03,通过G418抗性筛选得到啤酒酵母工程菌。实验室小试表明,工程菌的谷胱甘肽含量比受体菌株提高16.6%,啤酒的抗老化能力得到了显著提高,而常规指标没有发生显著变化。连续传代5次后胞内GSH含量基本不变遗传稳定性良好。由于表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因来源于受体菌株自身,是通过自克隆技术改造工业啤酒酵母的一次有益的尝试。     

构建高产谷胱甘肽啤酒酵母基因工程菌提高啤酒抗老化能力的研究

根据同源重组的原理,将来源于啤酒酵母工业菌株G03的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（GSH1）和筛选标记Kan取代质粒pRJ-5中18S rDNA内部约340bp的DNA片段,构建重组质粒pRKG。以pRKG为模版,PCR得到以18S rDNA为整合位点包含GSH1和Kan的基因片段18S rDNA::(Kan-GSH1)。用此片段转化啤酒酵母工业菌株G03,通过G418抗性筛选得到啤酒酵母工程菌。实验室小试表明,工程菌的谷胱甘肽含量比受体菌株提高16.6%,啤酒的抗老化能力得到了显著提高,而常规指标没有发生显著变化。连续传代5次后胞内GSH含量基本不变遗传稳定性良好。由于表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因来源于受体菌株自身,是通过自克隆技术改造工业啤酒酵母的一次有益的尝试。     

18S rDNA介导的FKS1基因过表达对酵母自溶性能的影响

酵母被誉为啤酒酿造的灵魂,然而随着啤酒高浓酿造技术的发展,酿造过程中渗透压增加、乙醇含量升高及营养平衡改变等会加快酵母的自溶,对啤酒的风味品质产生不利的影响。为提高酵母的抗自溶能力,本研究构建了以酿酒酵母18S r DNA序列为同源位点的FKS1过表达菌株。结果表明,过表达菌株细胞壁葡聚糖含量较原菌高62%;通过平板耐受性分析可知,FKS1过表达菌株在8%的乙醇浓度、0.4 mol/L Na Cl的渗透压冲击以及24 h饥饿培养的条件下,其胁迫耐受性均高于原始菌株;模拟自溶实验结果显示FKS1过表达菌株自溶速度缓慢,抗自溶能力明显优于原始菌株。该结果有助于探究酵母自溶的机理,同时也对提高啤酒风味品质和稳定性有着重要的意义。     

ILV2基因缺失对啤酒酵母生长与双乙酰代谢的影响

【目的】旨在应用分子生物学方法降低啤酒发酵液中双乙酰含量,改善啤酒感官质量。【方法】以酿酒酵母S2(Saccharomyces cerevisiae)为出发菌株,通过同源重组敲除四倍体啤酒酵母α-乙酰乳酸合成酶部分基因(ILV2),构建缺失一个和两个ILV2等位基因的突变株QI2-1和QI2-2,并进行啤酒发酵实验。【结果】ILV2基因的缺失,会导致菌株初始生长速率的降低。其中QI2-2较为明显,12 h时,突变株与出发菌株的生长速率达到一致。啤酒发酵结果表明,与出发菌株相比,突变株QI2-1双乙酰峰值与双乙酰最终含量分别降低17.50%和17.83%,而QI2-2分别降低51.67%和45.65%。其他啤酒指标如酒精度、发酵度、残糖和风味物质等略有变化,但都在优质啤酒指标范围内,符合啤酒发酵的质量要求。【结论】通过同源重组敲除部分ILV2基因和选育低产双乙酰菌株是降低啤酒双乙酰含量、提高啤酒质量的有效方法,具有一定的实际应用价值。     

啤酒酵母菌的细胞融合

啤酒多倍体酵母菌原生质体已成功地与单倍体原生质体进行融合。经细胞壁再生后,稳定的融合重组体被分离出来。这些融合体的基因分析表明,融合体中含有双亲的基因型。孢子形成良好,且每个子囊中含有四个孢子,每个孢子确实是二倍体。这样原生质体融合就提供了一个对啤酒酿造酵母进行遗传分析的方法。但是如果没有一个方便的杂交技术,这个方法将是很困难的。