通过枯草杆菌原生质体融合转移pUB110质粒的研究

在脱氧核糖核酸酶(DNase)存在的情况下,用聚乙二醇(PEG)方法,将枯草杆菌BD366(pUB110)(Thr~- Try~- Az~- Km~r Sm~s)的原生质体与枯草杆菌Ki-2-132(Thr~- Val~- Ile~- Km~sSm~r)的原生质体进行融合,在再生培养基上再生细胞壁,获得同时抗Km和Sm的融合体。融合频率在10~(-4)—10~(-7)之间。经测定,融合体的遗传性稳定。从融合体中挑出菌落形态与Ki-2-132相同的融合体A18、B20和B7,其质粒DNA带有Km~r基因,而且其琼脂糖凝胶电泳图与pUB110质粒DNA相同。因而确认pUB110质粒通过原生质体融合而进行转移。     

相同交配型酵母原生质体电融合及融合体的分析

本文报道了用电场诱导相同交配型啤酒酵母单倍体菌株原生质体融合。电场诱导的融合率比聚乙二醇(PEG)诱导的融合率高2—4倍。并对融合体进行了分析,融合体的细胞体积约为亲株细胞体积之和,DNA含量也比亲株高,有的为亲株的两倍,有的为亲株的三倍左右,融合体的生物量也比亲株高,如FD－5的生物量约为亲株的三倍,具有一定的生产应用价值。     

酵母菌属间原生质体融合获得能发酵乳糖生产酒精的融合体

本文报道了用聚乙二醇(PEG)诱导酿酒酵母 （Saccharomyces cerecisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)属间原生质体融合。融合体的细胞体积约为两亲株之和;融合体的DNA含量约为亲株的两倍;融合体具有双亲株的遗传标记。融合体不仅能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖和蜜二糖,而且也能发酵乳糖。在以乳糖为碳源的培养基中,融合体的发酵力是亲株乳酸克鲁维酵母的两倍多;在以葡萄糖为碳源的培养基中,融合体与亲株酿酒酵母的发酵力接近。     

棘孢小单孢菌和灰色链霉菌原生质体融合的研究

用庆大霉素产生菌——棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora 814(Gm~r,Km~r)和链霉素产生菌Streptomyces griseus No. 45(Sm~r,Lm~r)进行了原生质体融合。以抗性为选择标记,选出了融合体。其融合频率在10~(-3)—10~(-4)之间。在电镜条件下,观察了原生质体融合的详细过程,测定了融合体的产抗生素能力,其中一株融合体F106的抗生素产量比亲本菌株814高58％。用羧甲基纤维素薄层对发酵液层析表明,有一个融合体的发酵液比亲本菌株814多一个组份,但没有测出其生物活性。     

烟草花粉原生质体与叶肉原生质体的融合及培养早期变化

用ＰＥＧ—高Ｃａ高ＰＨ法诱导抗卡那霉素的烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）品系Ｎ３６４＋Ｋｍ＋花粉原生质体和黄花烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｒｕｓｔｉｃａ）叶肉原生质体融合。幼嫩花粉原生质体和叶肉原生质体之间的融合体培养启动胚胎发生分裂,经卡那霉素筛选后,少数多细胞团存活并形成小愈伤组织。成熟花粉原生质体与叶肉原生质体之间的融合体则仅产生管状结构。这一结果表明,作为融合一方的花粉原生质体的发育时期对融合产物的发育途径有重要影响。     

链霉素生产菌—灰色链霉菌和热灰紫链霉菌的原生质体融合的研究

本文采用原生质体融合技术,把链霉素生产菌——灰色链霉菌No．45 Streptomyces griseus No.45(Lin,Rif‘)同耐高温的不产生抗生素的热灰紫链霉菌T272 Strep-griseus thermogriseoviolaceus T272(Lin^s,Rif^f)进行了原生质体融合。以抗性为选择标记,以PEG6000为助融剂,选出了融合体。制备超薄切片后在电镜下观察了原生质体融合的详细过程。在链霉素生物合成受抑制的高温(37℃)下,测定了融合体的抑菌括性,从形态上与两亲株不同的46株融合体中发现6．3％的融合体既有耐高温的特性也有抑菌的活性。     

植物原生质体的游离和融合

通过原生质体融合进行体细胞杂交已或为研究植物遗传和育种的一个潜在新途径。在本报道中,我们描述了用酶法将小麦、大麦、玉米、红花和蚕豆等作物的叶片和根尖细胞游离成大量的完整的原生质体的方法。观察了在降低原生质体悬浮液的渗透浓度下,小麦、玉米及蚕豆的同源融合的过程。这种融合过程可在数分钟内完成。在上述植物中以小麦和玉米的同源融合率较高,分别达到15％和22％。还描述了获得诱发种间融合的方法。利用硝酸钠和降低渗透稳定剂浓度时,于蚕豆叶片和红花根尖的远缘种间原生质体间获得了融合体。诱发融合率达4％强。同时也观察到小麦叶片和红花根尖原生质体间的融合。     

产黄青霉ds RNA病毒通过原生质体融合的转移

将国内青霉素产生菌(Penicillium chrysogenum)的黄孢子系统及绿孢子(包括淡绿,灰绿)系统的十多个菌株,经过病毒提取、电镜观察、奥氏免疫双扩散、凝胶电泳及放射免疫测定,证明黄孢子系统的菌株含有不同滴定度的、直径40nm的球形病毒,而绿孢子系统中检查不出病毒。从营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒菌体中分离原生质体,进行不同组合的原生质体的融合杂交,获得营养互补融合的异核体。异核体1中,病毒通过胞质融合转移到原来无病毒的灰绿孢子菌株及细胞核融合后的杂合二倍体中。灰绿孢子的病毒量接近二倍体的1/3。二倍体菌落生长稳定,低温保存二年后经0.01—0.02M对氟苯丙氨酸(PFA)诱发和分离,产生亲本类型的分离子,分离子及二倍体仍然含有病毒。异核体2作亲本性分离,黄孢子仍有病毒,淡绿孢子及细胞核融合后产生的二倍体均无病毒,表明非感染性为显性。此种淡绿孢子的突变体中存在非感病菌系,它不支持病毒的复制。提取各杂交组二倍体内的病毒所特有的dsRNA时,可看出dsRNA的存在和病毒的存在一致。多数杂合二倍体的青霉素产量比亲本高。     

烟草雌性细胞原生质体的融合实验

将聚乙二醇诱导的单对原生质体融合技术应用于烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ）雌性细胞体外融合,成功地进行了雌性细胞间,雌、雄性细胞间,雌性细胞与体细胞间各种组合的融合实验。此外,应用微滴培养与微室饲养培养两种方法诱导了体细胞原生质体分裂并形成细胞团,为数目有限的性细胞融合体的培养奠定了技术基础     

水稻原生质体细胞核及原生质体融合体的简易染色观察法

筛选出一种荧光染料罗丹明B(Rhodamine B),利用该荧光染料染色,原生质体细胞核在普通光学显微镜或荧光显微镜下呈红色或发出强烈的桔红色荧光,能清晰地进行分辨。利用罗丹明B或者使用荧光染料FDA,对两种不同来源的原生质体进行染色,在荧光显微镜下,两种不同来源的原生质体分别发出桔红色或绿色荧光,因此可以用于原生质体融合中不同的融合体类型的观察和分析。     

产黄青霉d8RNA病毒通过原生质体融合的转移

将国内青霉素产生菌(Penicillum chrysogenum)的黄孢子系统及绿孢子(包括淡绿,灰绿)系统的十多个菌株,经过病毒提取、电镜观察、奥氏免疫双扩散、凝胶电泳及放射免疫测定,证明黄孢子系统的菌株含有不同谪定度的、直径40nm的球形病毒,而绿孢子系统中检查不出病毒。从营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒菌体中分离原生质体,进行不同组合的原生质体的融合杂交,获得营养互补融合的异核体。 异核体1中,病毒通过胞质融台转移到原来无病毒的灰绿孢子菌株及细胞核融合后的杂合二倍体中。灰绿孢子的病毒量接近二倍体的l／3。二倍体菌落生长稳定,低温保存二年后经0.01—0.02M对氟苯丙氨酸(PFA)诱发和分离,产生亲本类型的分离子,分离子及二倍体仍然含有病毒。异核体2作亲本性分离,黄孢子仍有病毒,淡绿孢子及细胞核融合后产生的二倍体均无病毒,表明非感染性为显性。此种淡绿孢子的突变体中存在非感病菌系,它不支持病毒的复制。提取各杂交组二倍体内的病毒所特有的dsRNA时,可看出dsRNA的存在和病毒的存在一致。多数杂合二倍体的青霉素产量比亲本高。     

水稻与大黍不对称休细胞杂交再生植株

采用ＰＥＧ（聚乙二醇）融合法,诱诱导水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）原生质体与无融合生殖大黍（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａｘｉｍｕｍ Ｊａｃｑ．）原生质体融合,经过融合体筛选、培养,成功地获得了再生植株并移栽成活。在融合前水稻原生质体经过２．５ｍｍｏｌ／Ｌ碘乙酰胺（ＩＯＡ）在室温（２２－２５℃）条件下处理１５ｍｉｎ,大黍原生质体经过６０Ｋｒ软Ｘ射线照射处理。对获得的２８株融合再生植株进行初步检测发现     

红霉素链霉菌无活性突变株原生质体融合的研究

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株L156和生产菌株LDC2经诱变剂处理,得到了5个无活性突变株.用琼脂条法进行了共合成的互补测定,发现它们分属于3个不同类群,并初步确定了它们在红霉素合成代谢路线上发生障碍的前后顺序。我们选择了无活性突变株L156—19Em-和LDC2-4,Em-做新本,进行原生质体融合.通过溶菌酶处理时间与原生质体释放数量间关系的列比试验,不同培养基与原生质体再生频率关系的对比试验,和用琼脂块法检出融合体的试验,发现在30℃温溶中溶菌酶处理1小时即可达到最高的原生质体释放量。不同的再生培养基对于原生质体再生频率有较大影响,其中R2L培养基效果最好,其再生频率可达36％,不加特殊成份的一般斜面培养基(ZL培养基)也可以作原生质体再生,只是再生频率较低(1.2％)。用琼脂块法检出融合体是切实可行的,融合频率为1.6％。     

电诱导酵母属与短梗霉属属间融合的研究

本文报道了经GH一401 型电诱导细胞融合、基因转移仪诱导实现的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae NK491) 与出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans NKB93—0061eu)的原生质体电诱导融合。在融合小罐中用3个强度为11 Kv／cm,时程为10μs的高压电脉冲处理原生质体,获得的融合子营养互补的融合频率为5.8×10^-5。在选择培养基上连续传代10次,然后在完全培养基上传代20次,最终得到4株稳定的融台子。融合子的细胞形态、大小、核的DNA含量以及酒精发酵等特性的观察和测定表明,4株融合子与双亲均有明显差异。实验结果表明,电诱导原生质体融台对酵母菌的属间融合是一种行之有效的方法,具有较高的融合频率。     

酿酒酵母和产朊假丝酵母原生质体的形成、再生及属间融合

使用由亚硝基胍诱变所得到的营养缺陷型作为单倍体融合亲株的核基因标记,同时也采用线粒体球红霉素抗性突变株的小菌落形式作为融合亲株的线粒体基因标记。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candida utilis)两亲株原生质体的制备是用对数生长早期的细胞在蜗牛酶和0.7M KCl及β-巯基乙醇或二巯基苏糖醇的作用下完成的。二者的原生质体的形成率在30—60分钟内达到90—99％。原生质体再生率,酿酒酵母最高为29—35％,产朊假丝酵母为7.5％。两亲株的原生质体在35％PEG(M.W.6,000),10mM CaCl_2条件下被诱导融合。在基础培养基上,长出以营养互补为标记的融合菌株。融合频率为10~(-5)—10~(-6)。试验表明,这些融合菌株具有杂种的性质。其中一株杂合子在同化D-木糖、纤维二糖等的能力上比亲株明显增强。     

芸苔属花粉—下胚轴原生质体融合再生杂种小植株

从青菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．）单胞中后期至二胞早期花粉分离出原生质体,用聚乙二醇法诱导其与甘蓝型油菜（Ｂ．ｎａｐｕｓＬ．）下胚轴原生质体融合。通过控制双亲原生质体的数量与比率,提高了异源融合率。融合体在离体条件下发生细胞分裂,形成愈伤组织,再生了小植株。染色体计数与酯酶同工酶酶谱分析初步证明获得了１ 株异源三倍体,２ 株异源四倍体。这是以游离花粉时期的原生质体与体细胞原生质体融合,取得“配子－体细胞杂交”成功的首次报道     

重组人白细胞介素11在毕氏酵母中的表达

将人白细胞介素11基因选用酵母偏爱密码子人工合成全基因,克隆到酵母分泌型表达载体pGENYk中,酶切线性化后原生质体转化导入酵母细胞进行整合,G418筛选得到多拷贝转化子,甲醇诱导表达,纯化制备产物,经过SDS－PAGE、Western印迹及体内外生物学活性等分析表明,产物活性与E.coli融合表达的Neumega一致。     

甘蓝型油菜与蔊菜的原生质体融合与植株再生

以甘蓝型油菜下胚轴和蔊菜叶片为外植体提取原生质体, 采用PEG-高pH、高Ca²⁺附加DMSO的原生质体融合方法, 用液体浅层静置培养融合体, 获得了10株融合杂种, 观察了杂种形态学和细胞学。结果表明：1%纤维素酶+0.2%离析酶+3 mmol/L MES 酶解14 h 可获得较高产率的油菜原生质体, 0.25% 纤维素酶+0.5%离析酶+5 mmol/L MES酶解12 h可获得较高产率的蔊菜原生质体; 30% PEG + 0.3 mol/L葡萄糖+50 mmol/L CaCl₂•2H₂O +15%DMSO的融合条件下, 获得了10.4%的融合率; 实验所获的原生质体融合材料可作为新种质。     

优良啤酒酵母原生质体融合株GR5的构建及其发酵特性

以发酵度较高的非絮凝性的啤酒酵母菌株X6和发酵度较低、絮凝性较强的啤酒酵母菌株N1为亲本进行原生质体融合。用亚硝酸诱变原养型的菌株X6,经筛选得到一株需酪素水解物的营养缺陷型菌株X6~20。采用正交试验法分别优化菌株X6~20和N1的原生质体形成和再生的条件。用X6~20菌株的原生质体作为受体和热灭活的N1菌株原生质体作为供体进行融合。融合株经三角瓶发酵筛选,得到一株较优良的融合株GR5。该融合株的絮凝性较强(本斯值为2.7),以12°Bx麦芽汁为培养基,用500 L的发酵罐在12℃下发酵,发酵至第8 d菌株GR5的发酵度为69.2%,发酵液中的双乙酰含量为0.0498 mg/L、乙醛含量为6.34 mg/L,总高级醇含量为74.4mg/L。融合株GR5具有双亲的优点,发酵的啤酒风味较好,是一株具有工业应用前景的啤酒酿造酵母菌株。     

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyueromyces lactis Y12—1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种问融合的研究。通过试验．原生质体形成及再生的最佳条件为：对数期的细胞,2％的蜗牛酶．30℃酶解30分钟．原生质体形成率90％以上,再生率20%左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-l不能旋酵菊糖;K.fragilis 8554不能同化D－松三糖和麦芽糖;利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D－松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别．在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14一l6％;连续15次传代,融合子稳定。