红色毛癣菌孢子期与萌芽期基因表达比较分析

红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)是最常见和流行范围最广的一种浅部感染真菌, 它的孢子萌发是和致病密切相关且非常重要的发育过程. 为研究出芽时生理、生化以及细胞学方面的改变, 从红色毛癣菌cDNA文库中选取了3364条有明确功能注释的表达序列标签(ESTs)制备了cDNA芯片, 对孢子期及萌芽期进行了基因表达变化的研究. 数据分析表明, 孢子萌发过程中有335个基因表达上调, 主要是翻译、 修饰蛋白及结构蛋白. 细胞壁和细胞膜组分大量合成, 暗示它们是细胞形态发生的基础. 二组分信号转导系统的组成部分表达上调, 推测它可能在红色毛癣菌孢子萌发过程中起着重要作用. 各种代谢途径表达旺盛, 特别是参与糖酵解和氧化磷酸化的基因基本都上调, 说明在氧气和葡萄糖充足的环境下, 孢子主要通过有氧呼吸获得能量. 本研究对了解红色毛癣菌孢子萌发过程中基因表达的变化及其信号转导和代谢特点提供了重要线索, 对其他浅部真菌的研究也具有重要意义.     

红色毛癣菌不同生长阶段的基因表达谱分析

红色毛癣菌是最重要的浅表感染真菌.目前对红色毛癣菌分子和遗传学方面的研究还比较有限.应用cDNA芯片技术对红色毛癣菌不同生长阶段的基因表达谱进行了分析,获得了2044个在不同生长阶段差异表达的基因.聚类分析表明,这些基因可以分为3种不同的表达模式.本研究验证了先前的结论,即在红色毛癣菌中存在预储存的mRNA.对不同生长状态下转录谱和基因功能分析表明,糖酵解过程中的一些重要的酶具有相似的表达模式,说明在红色毛癣菌的生长过程中,这些酶可能具有共同的调控模式.同时,在红色毛癣菌生长过程中,一些参与诸如小GTPase调控、cAMP依赖的调控途径以及MAPK信号传导途径的基因表达也发生了变化.尽管这些基因和相关的调控途径在红色毛癣菌中的具体生物学功能还不清楚,但它们可能在其生长过程中起了调控作用.     

红色毛癣菌部分表达序列标签的分析

红色毛癣菌是最常见和流行范围最广的一种浅部致病真菌. 在构建红色毛癣菌cDNA文库的基础上, 获得4002条ESTs. 与GenBank数据库中的序列同源性比较表明, 其中30%(1226条)与其他生物已知功能的基因产物具有不同程度的同源性, 24.81%(989条)仅得到简单的功能提示, 45.19%(1787条)与目前已知的任何蛋白质都没有显著同源性, 为全新的未知功能基因. 对一些与红色毛癣菌生长代谢、信号传导、致病和耐药相关的重要功能基因做了初步分析, 阐明了红色毛癣菌的部分重要代谢途径, 为进一步探索其生理过程、致病和耐药机理, 寻找新的药物靶标提供了重要的分子基础和线索.     

高通量测序分析不同浓度的白鲜碱对须癣毛癣菌转录组的影响

[背景]目前,由皮肤浅部真菌引起的皮肤病逐年增加,已经成为影响人类健康的重大问题之一。[目的]探究白鲜碱(dictamnine,DIC)单体对须癣毛癣菌的抑菌作用及作用机制。[方法]通过高通量测序技术对须癣毛癣菌及白鲜碱作用后的须癣毛癣菌进行转录组测序,对测序序列进行处理和生物信息学分析,以及测序质量评价和序列注释。通过与对照组比较,鉴别出差异表达基因,然后进行GO功能显著性分析和KEGG代谢途径分析等。[结果]白鲜碱对须癣毛癣菌的MIC值为50μg/mL。DIC高剂量组与对照组比较,共360个差异基因;其中上调表达265个,下调表达95个。MFS1、KU70、KU80、L2、cpaT、MFS2、VdtG、patC等基因表达有显著差异。GO功能富集表明,差异基因主要集中于核糖体、线粒体膜、抗氧化活性、毒素代谢过程、单一生物代谢过程、次生代谢过程、初级活性跨膜转运蛋白活性和活跃的跨膜转运蛋白活性等。KEGG代谢途径的改变主要集中在ABC转运、膜运输障碍、谷胱甘肽代谢、DNA的复制与修复变化、减数分裂、氧化磷酸化和丙酮酸代谢障碍等富集通路上,并且相关基因均有显著性改变(P<0.05)...     

红色毛癣菌pho88基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)无机磷酸盐转运蛋白(Inorganic phosphate transporter,PHO88)基因,构建原核表达质粒,并对PHO88蛋白进行生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的T. rubrum CBS 118892菌株pho88基因序列(XP-003235348),设计合成特异性引物,提取红色毛癣菌总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增pho88基因,构建到原核表达载体p ET-28a上,测序鉴定其序列,并对其进行生物信息学分析。[结果]红色毛癣菌pho88基因全长582 bp,编码193个氨基酸。PHO88蛋白含有1个跨膜结构域,细胞亚定位为分泌信号途径蛋白,PHO88含有16个磷酸化修饰位点,其二级结构主要由α-螺旋构成,高级结构为全α型蛋白质。[结论]成功克隆红色毛癣菌pho88基因及构建原核表达质粒,为后续PHO88蛋白的诱导表达奠定基础,为后续开发靶向PHO88的抗真菌药物,提供实验基础。     

红色毛癣菌蛋白酶MEP和SUB的表达及临床意义

目的探讨红色毛癣菌蛋白酶MEP和SUB的表达及临床意义。方法抽提红色毛癣菌总RNA,采用半定量RTPCR法检测红色毛癣菌金属蛋白酶(Metalloproteinases,MEP)、枯草菌素蛋白酶(subtilisins,SUB)基因表达量的变化。结果不同病例的红色毛癣菌SUB的表达水平与临床症状的严重程度密切相关,而与患者的年龄、性别、病程等无明显相关性;MEP的表达水平在不同年龄、性别、病程和临床分型等方面存在一定差异,但无显著意义。结论红色毛癣菌致病力的大小可能与SUB的不同表达有关。     

免疫性损伤小鼠肝脏的基因表达谱变化

采用卡介苗和脂多糖联合诱导的方法建立小鼠免疫性肝损伤模型, 分别提取正常对照组与免疫性肝损伤组小鼠的肝脏总RNA, 经反转录用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP分别标记制备对照组与模型组来源的cDNA探针, 并将cDNA探针与小鼠基因表达谱芯片杂交, 杂交结果经芯片扫描仪扫描并用相关软件进行分析. 结果表明, 与对照组相比, 免疫性肝损伤组有293条基因发生了差异表达, 其中188条基因表达量明显上调, 另外105条基因表达量明显下调. 通过对一些关键差异表达基因的生物学功能分析表明, 卡介苗与脂多糖联合诱导的小鼠免疫性肝损伤的发生、发展过程与肝细胞的免疫反应、细胞合成与代谢、细胞凋亡及转运等过程密切相关, 这对进一步阐明免疫性肝损伤高度相关的基因表达调控网络, 进而阐明免疫性肝损伤的病理机制具有十分重要的作用.     

联苯培养条件下红球菌R04转录表达和苯甲酸代谢途径解析

摘要:【目的】研究不同碳源,特别是联苯条件下红球菌的细胞转录应答,以挖掘与多氯联苯(PCBs)转运、代谢及其调控相关的基因,为进一步全面理解PCB微生物降解的分子机制奠定基础。【方法】以一株多氯联苯降解菌红球菌(Rhodococcus sp.R04)为材料,分别提取不同碳源(乙醇、葡萄糖和联苯)培养条件下菌体的总RNA,反转录合成cDNA。采用高通量测序法分别对这三种样品进行转录组测序,分析测序数据得出全基因组表达模式,并对不同条件下的基因表达进行差示分析,进而对联苯代谢网络和红球菌中其他基因的转录调节和代谢应答反应做出相关性分析。Q-RT-PCR分析不同碳源培养条件下的基因表达情况。【结果】测序结果表明,与葡萄糖和乙醇相比,联苯培养条件下明显上调(log2 Ratio 1)基因个数分别为375和332个。与葡萄糖相比,联苯培养条件下,相关基因上调表达量与Q-RT-PCR实验结果基本一致。功能分类获得细胞组分、分子功能和生物学过程三大类别160多个细小分支的差示表达基因,部分基因参与联苯代谢转录调控、联苯转运、抗氧化应激反应以及信号传导通路系统等多种生理过程。参与联苯上游代谢途径的众多同工酶基因中,只有bphC2和bphD1在联苯中大量上调表达,其余同工酶在联苯中基本量不变或下调表达。转录组注释及差示分析推测,红球菌R04中苯甲酸的代谢主要是通过儿茶酚邻位途径、间位途径以及原儿茶酸途径三条代谢途径完成。【结论】与葡萄糖和乙醇相比,红球菌R04在联苯培养条件下基因表达差异明显,这为我们进一步解析多氯联苯代谢特征和代谢调控提供理论依据。     

红色毛癣菌菌株的特异性PCR鉴定方法研究

目的建立一种快速的红色毛癣菌分子生物学鉴定方法。方法根据红色毛癣菌保守区域-真菌核糖体DNA（rDNA）的转录间隔区（ITS）设计特异性引物,采用上游：ITS19865＇GAC ACC AAG AAA AAA TTC TCT GAA GA3＇,下游：ITS24415＇GTC CTG AGG GCG CTG AA3＇为引物对45株红色毛癣菌、5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌菌株的DNA进行PCR扩增,观察产物电泳带型的差异。结果 45株红色毛癣菌均能扩增出目的片段,5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌均无目的片段扩增出。结论红色毛癣菌可用特异引物PCR方法快速鉴定。     

CLSI M38-A2及M27-A3方案分析足癣36株真菌的药敏特征

目的探讨氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬、两性霉素B、咪康唑、5-氟胞嘧啶对36株足癣致病菌的体外抑菌特征。方法对55例临床疑似足癣患者行真菌镜检、培养和鉴定。分别应用美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)M38-A2和M27-A3方案针对其中的皮肤癣菌和念珠菌,检测8种药物对不同真菌的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。结果镜检及培养均为阳性的真菌36株,计8个菌种:红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状毛癣菌、羊毛状小孢子菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌;属2大类:皮肤癣菌、念珠菌。8种药物对8种真菌的MIC值比较,抑菌效果存在显著差异(P0.05)。皮肤癣菌和念珠菌2大类比较,除伊曲康唑外(P0.05),其余7种药物的抑菌效果存在显著差异(P0.05)。其中,特比萘芬对皮肤癣菌的平均秩次最小。5-氟胞嘧啶对念珠菌的平均秩次最小。结论上述8种药物的体外药敏实验提示,8种药物对8种真菌的抑菌效果存在显著差异。除伊曲康唑外,其余7种药物对皮肤癣菌和念珠菌的抑菌效果存在显著差异。相对而言,特比萘芬对皮肤癣菌抑菌效果更好,5-氟胞嘧啶对念珠菌抑菌效果更好。     

荆皮癣湿酊对红色毛癣菌的抗菌作用机制

【目的】探讨荆皮癣湿酊(Jingpixian Tincture,JPXT)对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的抗菌作用和机制。【方法】微量稀释法测定荆皮癣湿酊对红色毛癣菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);荧光显微镜观察荆皮癣湿酊对红色毛癣菌孢子萌发和菌丝生长的影响;山梨糖醇保护试验测定荆皮癣湿酊对红色毛癣菌细胞壁的影响;流式细胞仪检测红色毛癣菌细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;酶标仪测定细胞内核酸释放量;高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测细胞膜麦角甾醇含量;酶标仪检测β-1,3-葡聚糖合酶(β-1,3-glucan synthase,β-1,3-GS)、几丁质合成酶(chitin synthetase,CS)、角鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQLE)、14α-去甲基化酶(14-alpha demethylase,CYP51)活性;实时荧光定量PCR (real-time q...     

基因芯片技术研究柽柳NaHCO3胁迫下基因的表达

运用基因芯片技术研究了NaHCO3胁迫下柽柳(Tamarix androssowii)基因的表达.将Cy5和Cy3两种荧光染料分别标记在NaHCO3处理和对照的柽柳cDNA上,将两种荧光探针混合,与载有柽柳基因的高密度芯片进行杂交并用芯片扫描系统进行扫描,通过Cy5与Cy3信号强度比值的计算研究基因的差异表达.共获得了89个差异表达的基因,其中,27个下调表达,62个上调表达.BlastX分析表明这些基因按功能可以分为光合作用、活性氧清除、渗透调节、信号传导与表达调控、代谢、发育相关、核糖体蛋白、蛋白质的分解与再生、转运类蛋白、水通道蛋白等几大类别.同时,发现了一些与盐胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因,这些基因可能在柽柳抗盐过程中具有重要作用.揭示了柽柳的抗盐胁迫涉及的几种重要途径,并获得了NaHCO3胁迫前后柽柳基因表达谱.     

应用微阵列技术筛选PS1TP1基因转染细胞差异表达基因

阐明乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白反式激活蛋白1(PS1TP1)的表达对于肝细胞的基因表达谱的影响.应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-PS1TP1分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.以肝癌细胞系HepG2基因作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PS1TP1基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-PS1TP1.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.在4096个基因表达谱的筛选中,发现有8个基因表达水平显著上调,14个基因表达水平显著下调.PS1TP1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径.     

红色毛癣菌分泌性蛋白酶的分析

分泌性蛋白酶是红色毛癣菌致病的潜在毒力因子。在构建红色毛癣菌6个不同时间段cDNA文库的基础上,共获得了9683条uniqueESTs,通过生物信息学分析从中得到了18个可能的分泌性蛋白酶的EST序列,包括4个分泌性肽酶、1个分泌性金属蛋白酶、2个细胞外丝氨酸蛋白酶、1个分泌性天冬氨酸蛋白酶、9个分泌性枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、1个空泡丝氨酸蛋白酶。这些分泌性蛋白酶在红色毛癣菌感染过程中可能分别与其获得营养、扩大侵袭范围及激起宿主免疫应答有关,这些结果为进一步研究红色毛癣菌感染和发病机制提供了重要的分子基础和线索。     

细胞凋亡和代谢基因在转移倾向结肠癌中的研究

目的:应用基因微阵列技术初步筛选与不同转移倾向结肠癌相关的细胞凋亡和代谢相关基因,研究转移相关基因功能.方法:取结肠癌肝转移和无转移结肠癌组织,采用人全基因组表达谱芯片获得两组织的基因表达谱,分析比较两者之间细胞凋亡和代谢基因的差异表达情况;利用基因数据库检索结肠癌相关基因,分析基因功能.结果:应用含有16450个克隆(其中3869个未知)的cDNA微阵列分析发现,细胞凋亡或肿瘤相关基因中,2倍以上(Ratio值小于0.5或大于2.0)差异基因共216个,上调基因85个,下调基因129个.表达差异5倍以上(Ratio值小于0.2或大于5.0)共32个,上调基因10个,下调基因22个.在细胞代谢相关基因中,2倍以上(Ratio值小于0.5或大于2.O)差异基因共205个,上调基因86个,下调基因119个.表达差异5倍以上(Ratio值小于0.2或大于5.0)共15个,上调基因10个,下调基因5个.利用基因数据库检索分析发现5个基因与结肠癌转移关系密切.结论:结肠癌的发生和转移是多基因参与的,本实验应用基因微阵列技术发现细胞凋亡和代谢相关基因中发现5个基因与结肠癌转移关系密切.     

应用基因芯片检测酸味抗病甜瓜果实基因表达

利用Melon cDNA array ver1.0检测新疆厚皮甜瓜(Cucumis melo var.ameri)果实基因表达的可行性,并检测了经60Coγ射线辐射诱变后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病变异株成熟果实基因的表达.结果显示:该芯片平均能够检测新疆厚皮甜瓜基因2 008个,检测出的基因占该芯片基因探针总数的65.4%;检测酸味抗病变异株上调表达的基因251个,占检出基因总数的12.5%;下调表达的基因224个,占检出基因总数的11.16%.利用RT-PCR验证芯片结果的可靠性,结果表明,用Melon cDNA array ver 1.0检测新疆厚皮甜瓜成熟果实基因表达水平是可行的.     

转录因子XBP1S基因表达谱差异分析

目的 应用基因表达谱芯片技术了解XBP1S在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法 构建pcDNA3.1（-）-XBP1S真核表达载体,转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1（-）处理相同细胞系作为对照.48 h后制备细胞裂解液,提取mRNA,应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行基因表达谱芯片技术分析.经过差异基因表达谱的筛选,发现HepG2细胞转染XBP1S以后,有38个基因表达水平显著上调,30个基因表达水平显著下调.结论 成功构建XBP1S的真核表达载体pcDNA3.1（-）-XBP1S,运用基因表达谱芯片技术成功筛选了XBP1S转染细胞后的差异表达基因,这些差异表达基因包括细胞周期、蛋白质的翻译合成及运输、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号转导等方面起重要作用及肿瘤发生相关的基因,为进一步阐明XBP1S可能存在的调控机制及XBP1S蛋白可能的生物学功能提供理论依据.     

肿瘤相关基因表达检测寡核苷酸芯片的制备及其初步应用

为研制肿瘤相关寡核苷酸芯片,并实现其在抗肿瘤反义核酸“癌泰得”作用机理研究方面的初步应用,制备了包含近450种肿瘤相关基因特异寡核苷酸探针的寡核苷酸芯片,建立了相应的质控标准.“癌泰得”用脂质体转染HepG2肿瘤细胞,提取细胞总RNA反转录并荧光标记cDNA,用制备的寡核苷酸芯片检测肝癌细胞HepG2的肿瘤相关基因表达水平,用软件分析获得其差异基因表达谱.0.4 μmol/L的反义核酸“癌泰得”作用于HepG2细胞15 h后,MDNCF、DHS等基因mRNA表达下调,MUC2、MPP11、LAT、HRIF-B、JNK3A1等mRNA基因表达上调,初步检测到了“癌泰得”的抗肿瘤作用可能的相关基因,为进一步的分子作用机理的探讨奠定基础.结果表明,制备的肿瘤相关芯片敏感度高、特异性高、重复性均较好,可用于检测肿瘤相关基因的表达谱,为临床诊断和基础研究提供了技术平台.     

荆皮癣湿酊诱导红色毛癣菌凋亡的机制研究北大核心

【目的】本研究旨在探讨复方中药荆皮癣湿酊(Jingpixian tincture,JPXT)对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的凋亡诱导作用,以阐明其可能的抗真菌作用机制。【方法】采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)评价荆皮癣湿酊对红色毛癣菌生长活力的影响;流式细胞仪检测红色毛癣菌细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)变化;Annexin V-FITC/PI染色荧光显微镜观察红色毛癣菌细胞磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻情况;流式细胞术检测红色毛癣菌细胞凋亡率;FITC-VAD-FMK染色观察红色毛癣菌偏半胱天冬酶(metacaspase)活性;紫外分光光度计测定红色毛癣菌细胞色素C氧化酶的活性。【结果】荆皮癣湿酊处理后的红色毛癣菌细胞活力与MMP水平均有所降低,ROS水平显著升高,PS外翻与凋亡率明显增加,偏半胱天冬酶活性显著升高,细胞色素C氧化酶活性降低。【结论】荆皮癣湿酊可通过诱导菌体凋亡的方式发挥对红色毛癣菌的抗菌作用。     

基于转录组分析铜绿假单胞菌DN1降解荧蒽特性

[背景]铜绿假单胞菌DN1是一株从石油污染土壤中分离筛选到的具有广谱降解功能的菌株。[目的]深入了解荧蒽胁迫条件下铜绿假单胞菌DN1降解污染物过程中重要的降解相关基因信息。[方法]通过高通量测序技术对铜绿假单胞菌DN1进行转录组测序,对其所有的转录本进行KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)分类和Pathway注释、GO (gene ontology)分类和富集分析。[结果]转录组测序显示:与对照组相比,荧蒽诱导组检测到6 189个基因,其中1 919个基因上调表达,1 603个基因下调表达。KEGG注释分析显示差异上调表达基因匹配到了112个KEGG代谢途径,注释到"代谢途径"的1 408个基因(约占总差异基因的73.4%)中有317个基因参与了碳氢化合物代谢及含有苯环结构的异源生物质的生物降解,占"代谢途径"的16.53%,暗示了菌株DN1降解荧蒽可能与这些途径有密切关系。另外,主要代谢途径中的差异表达基因主要集中在ABC转运系统、氨基酸生物合成、双组分系统及碳代谢,这些途径大多数参与了底物的识别转运、信号转导及基因表达调控。[结论]进一步拓展了铜绿假单胞菌DN1在荧蒽胁迫条件下的代谢途径和逆境反应,也为微生物修复环境污染物研究夯实了理论基础。