肝细胞粘弹性实验研究

采用微管吸吮技术考查肝实质细胞癌细胞粘弹性特性,并与采用秋水仙素处理微管蛋白后的肝癌细胞及正常胎肝细胞粘弹性进行对照。选择标准线性固体模型拟合实验结果并用三个粘弹性系数比较各组肝细胞的力学性质。实验结果表明肝实质细胞癌细胞较胎肝细胞更容易变形,而经秋水仙素处理后的肝癌细胞运动或变形能力下降,细胞刚性增加。正常胎肝细胞具有较高的弹性,类似于淋巴细胞核的力学性质。该结论还对定量研究肝瘤转移和治疗有方法学参考意义。     

细胞松弛素D、秋水仙素作用下大鼠肝癌细胞中黏弹性的研究

采用微管吮吸技术测定大鼠肝癌细胞的黏弹性;研究了秋水仙素、细胞松弛素D以及两者混合作用后对于肝癌细胞黏弹性的影响。结果表明:用CD处理癌细胞后发现癌细胞的弹性系数K1明显下降。与对照组相比:微丝骨架被CD抑制后,在加入Col后肝癌细胞的弹性系数K1显著降低;而微管骨架被col抑制后,在加入CD后肝癌细胞的弹性系数K1、K2和μ无明显变化。提示在微管骨架系统完整的情况下,微丝对肝癌细胞的黏弹性系数的的影响起主要作用。而微管骨架系统受到破坏后,微丝需借助于微管网络的作用来影响细胞的黏弹性。本研究对揭示癌细胞中骨架系统之间的交互作用对于细胞黏弹性的影响提高实验依据。     

不同细胞周期大鼠肝实质细胞癌细胞粘弹特性研究

以胸腺嘧啶核苷和秋水仙碱顺序阻断法及胸腺嘧啶核苷双阻断法分别获得同步化Ｇ１期和Ｓ期细胞,从细胞周期角度出发,采用微管吸吮技术对大鼠肝实质细胞癌细胞的粘弹特性进行了测定并以标准线性固体模型对实验数据进行了拟合,结果表明：该细胞具有高弹性和低粘性的总体特征;Ｇ１期细胞与Ｓ期细胞相比具有高Ｋ１值和低μ值的特点,从而显示Ｇ１期细胞比Ｓ期细胞具有更大的强度和更快的被动变形能力。这些结果不仅反映了同步化细胞存在的细胞骨架状态的周期性差异,也提示Ｇ１期细胞可能比Ｓ期细胞更适于在血流中存活和转移。     

肝癌细胞与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面粘附特性

本文以正常胎肝细胞的原代培养及肝癌细胞的传代培养为基础,应用微管吸吮技术在单个细胞水平上研究肝实质细胞癌细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力学特性。实验将正常原代肝细胞与肝癌细胞进行对照,阐明肝癌细胞与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面粘附行为的时间与浓度依赖性,结果表明肝癌细胞与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面具有更强的粘附力。这一研究对肝癌转移的定量研究有方法学的参考意义。     

肝癌细胞整合素受-配体比与其粘附稳定性的相关性实验研究

整合素与其胞外基质配体间的相互作用对调节细胞的粘附和运动起着重要的作用.肝癌细胞的胞外基质减少,而整合素β1的表达却增高,其比例失衡影响肝癌细胞的粘附与运动行为.作者通过细胞形态学观察、图像分析,微管吸吮和流式细胞仪等手段,对肝癌细胞、正常肝细胞的整合素表达水平、裱衬Fn前后肝癌细胞的运动能力及粘附力进行检测和定量分析,发现肝癌细胞的整合素表达量高于正常肝细胞;肝癌细胞粘附力较正常肝细胞低,迁移速度增快,补充适当浓度胞外配体Fn可使胞外受配体比例恢复到正常肝细胞的整合素表达水平,裱衬Fn后肝癌细胞的粘附力增强,细胞运动能力减弱.这些结果说明胞外配体Fn对肝癌细胞整合素表达有下调作用,肝癌细胞的受.配体比例是影响其粘附和运动的因素之一.     

膜蛋白巯基的氧化还原修饰对红细胞膜粘弹特性的影响

以正常人红细胞为样本,用巯基反应试剂对膜蛋白巯基进行氧化－还原修饰;用微管吸吮技术和生化分析,研究红细胞膜粘弹特性与膜蛋白巯基间的相关性。结果表明：在二酰胺（ｄｉａｍｉｄｅ）氧化修饰下,膜蛋白巯基含量降低,膜弹性膜量μ和粘性系数η均增加,而且随二酰胺浓度增加,它们的变化程度越大;在巯基乙醇还原修饰下,膜蛋白巯基含量增加,而弹性膜量μ和粘性系数η都降低;膜蛋白巯基含量与膜粘弹性系数μ和η呈负线性相关。根据实验结果,本文就引起红细胞膜粘弹特性变化的膜基团反应机制,进行了初步的分析和讨论     

丙烯酰胺和细胞松弛素D作用下大鼠肝细胞中黏弹性的研究

采用微管吮吸技术测定了大鼠肝细胞的黏弹性,进一步研究了丙烯酰胺(acrylamide)和细胞松弛素D(cytochalasin D,CD)以及两者混合作用后对于细胞黏弹性的影响。结果表明:在用CD、丙烯酰胺以及CD、丙烯酰胺混合处理细胞后发现细胞的黏弹性系数均明显下降。尤其是对K1的影响最大中间纤维对于黏弹性系数K1的影响要大于微丝对K1影响。而微丝于黏弹性系数K2的影响要大于中间纤维对K1的影响。另外在丙烯酰胺和细胞松弛素D两者混合作用后细胞的黏弹性系数均比两者单独使用时呈显著下降的趋势。提示中间纤维、微丝在维持细胞黏弹性这一生物力学特性方面均起着一定的作用。另外从以丙烯酰胺组和细胞松弛素D组为照组的数据中发现:丙烯酰胺和细胞松弛素D两者混合作用后细胞的黏弹性系数K1或K2也存在一定程度的降低。中间纤维和微丝可能对正常肝细胞黏弹性有一定之间的交互影响的作用。     

去核过程中CHO细胞波形纤维的分布

本文用豚鼠抗小牛晶状体波形纤维蛋白的血清抗体,对经细胞松驰素B(CB)和秋水仙素等药物处理后再离心去核的CHO细胞及其核体、胞质体进行了间接免疫荧光染色,并对核体做了电镜观察。CB处理后离心的细胞的免疫荧光染色显示,去核过程中核的后方始终伴有强烈的荧光,核体上也有强荧光斑。在核体的电镜材料中同样观察到了中等纤维。经CB和秋水仙素合并处理后离心的细胞,去核效果比仅用CB处理有明显的增强,免疫荧光染色表明,核后的荧光并不因秋水仙素处理而消失。实验结果表明:1.微丝对维持细胞表面的完整性有重要作用,CB能破坏微丝故有利于离心去核。2.中等纤维与核之间存在密切联系,这种联系在核膜的某些区域比较集中、牢固,不易为离心力所破坏。3.微管对核固着作用有重要意义,细胞核可能通过中等纤维与微管相连而抛锚在胞质中,故秋水仙素可增强去核作用。微管对维持细胞表面强度可能也有一定作用。     

核微管组织中心的研究

本文利用间接免疫荧光手段对间期核微管组织中心的性质进行了初步探讨。当分离核与6S微管蛋白保温后,用抗管蛋白抗体进行间接免疫荧光染色,在群体中只有极少数核上有微管生长。Triton X-100或溶血卵磷脂去膜核的实验证实能长微管的核是核膜缺失或破损核。用秋水仙素解聚核上长出的微管,可见核内荧光亮点数多于染色体数,说明核内微管组织中心数目多于着丝粒数,很可能包括着丝粒和一部分染色质颗粒。将秋水仙素和6S微管蛋白混合后与去膜核保温,结果6S微管蛋白与核内微管组织中心有亲和力。本文就这些结果进行了讨论。     

衰老标记蛋白30 mRNA在癌细胞中的表达研究

目的:检测衰老标记蛋白(SMP)30 mRNA在不同癌细胞系中的表达情况,探讨其在不同细胞中的表达差异。方法:分别采用RT-PCR与荧光定量PCR检测SMP30 mRNA在正常肝细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞中的表达,并用SPSS13.0进行统计学分析。结果:SMP30 mRNA在所有被检测的细胞株中均有表达,在癌细胞中的相对表达量分别为肝癌细胞(0.926±0.340)、胃癌细胞(0.922±0.379)、乳腺癌细胞(0.614±0.356)、宫颈癌细胞(0.608±0.346),而在正常肝细胞中为0.175±0.158,显示SMP30 mRNA在癌细胞中的表达量较正常肝细胞中高(P0.05),且在肝癌细胞中的表达量比在其他癌细胞中更高。结论:SMP30 mRNA在癌细胞中的表达高于正常肝细胞,且在肝癌细胞中的表达高于其他癌细胞,具有临床应用价值。     

integrin β1在不同细胞周期肝癌细胞与内皮细胞粘附中的作用

探讨了integrin β1在不同细胞周期人肝癌细胞(SMMC-7721)上的表达和在肝癌细胞与人脐静脉内皮细胞粘附过程中的作用.未同步处理的肝癌细胞(对照组)各细胞周期时相百分比为G0/G1期53.51%、G2/M期11.01%、S期35.48%,采用胸腺嘧啶脱氧核苷、秋水仙碱顺序阻断和胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养的方法获得G1期和S期的肝癌细胞,其同步率分别为74.09%和98.29%.G1期肝癌细胞integrin β1表达的荧光强度较S期和对照组相应值明显降低.利用微管吸吮技术定量研究了肝癌细胞与内皮细胞之间的粘附力学特性,发现G1期肝癌细胞的粘附力值比S期相应值明显降低(P＜0.01),而S期的粘附力值与对照组比较无明显差别,integrin β1在肝癌细胞与内皮细胞粘附过程中的贡献约50%.结果提示胸腺嘧啶脱氧核苷和秋水仙碱能较好地将肝癌细胞同步于G1期和S期,integrin β1在SMMC-7721肝癌细胞上的表达水平呈现周期差异,在肝癌细胞与内皮细胞粘附过程中,S期细胞可能起的作用更大,integrin β1在这一粘附过程中起着重要作用.     

钙调素抑制剂——三氟拉嗪对肿瘤细胞增殖和微管组装的影响

本文用钙调素抑制剂——三氟拉嗪处理人胃癌MGC-803细胞,用免疫荧光细胞化学方法,放射免疫法和速流荧光分析等方法研究了钙调素对细胞增殖,环核苷酸代谢及微管组装,有丝分裂等细胞功能的调节作用。实验结果表明,TFP明显地抑制了人胃癌细胞的增殖,这种抑制增殖的作用,具有剂量和时间依赖关系,细胞群体中G_1期细胞增多,S期细胞下降,DNA合成明显地受到抑制。TFP处理的胃癌细胞仅在短时间内(5'-30')cAMP含量升高,cGMP浓度降低,cAMP/ ??cGMP比值比对照组高4.4倍,但此后环核苷酸含量又很快恢复到对照组水平。本实验还观察到TFP处理后的MGC-803细胞胞质铺展,细胞形态的改变与胞质微管的分布有密切联系,实验结果表明TFP加强了人胃癌细胞MTOC对微管的组装能力,使微管分布得到恢复,微管纤维呈放射状延伸到细胞边缘,充满胞浆,使细胞呈现出展平的多边形,趋向于正常上皮细胞形态的变化,本实验结果表明TFP抑制癌细胞增殖及使微管组装加强可能是通过对CaM活性的抑制作用。此结果有助于说明转化细胞内钙调素的变化,可能是与转化细胞增殖失控和胞质微管消退有关。     

转移性人肝癌类组织体模型的建立

为了探讨三维培养状态下人肝癌细胞的生物学特征和转移潜能,利用旋转壁式生物反应器(rotating wall vessel, RWV)结合生物支架材料,将高转移性人肝癌细胞(MHCC97H)成功地构建成一种新的转移性人肝癌类组织体模型,针对肝癌细胞的临床病理特征,一系列体外和体内实验包括组织形态、显微结构、蛋白质产生和分泌、葡萄糖代谢、组织特征基因表达、细胞的生长和凋亡,以及在裸鼠中的成瘤性和转移性等对模型进行检测评估,结果均显示,该模型能较好地模拟转移性人肝癌组织的病理特征,且优于单层培养的人肝癌细胞,该模型可能对肝癌转移分子机制探讨、抗癌药物筛选以及肝癌动物模型建立产生积极的推动,同时也表明肝细胞癌(HCC)细胞的立体形态结构对维持肝癌细胞生物学功能十分重要．     

秋水仙素对小麦根尖细胞亚显微结构的影响

在不同浓度和处理时间下用秋水仙素处理小麦很尖,发现根尖分生区细胞的亚显微结构发生了程度不同的变化。表现在核占细胞体积的比例减小,形态变化多样;内质网由分散分布到形成聚集体;原质体减少而淀粉质体增加;微体减少;液泡增大;细胞壁不均匀地加厚且细胞间隙增大等方面。初步讨论了秋水仙素引起的微管解聚是内质同、质体、微体、核等所处的状态和细胞壁不均匀加厚的主要原因。探测了秋水仙素对小麦根尖细胞亚显微结构影响的一般临界浓度和处理时间。从结果看,秋水仙素处理小麦根尖分生区细胞后,其原有的状态发生了改变,导致了分生细胞从胚性转向分化。     

微管骨架在苔藓植物适应干旱胁迫应答中的功能研究

植物体通过一系列生理生化反应的改变来适应干旱胁迫。对干旱/复水及秋水仙素处理后再干旱/复水的仙鹤藓(Atrichum undulatum)原丝体细胞中微管骨架的动态变化进行了研究,发现干旱处理后细胞内微管骨架从有规律排列的较细的丝状形式转换为无规律排列的较粗的微管束;复水后微管骨架的结构和分布与对照细胞中无明显区别;秋水仙素处理后再干旱/复水的细胞中,微管骨架呈分散的棒状或点状分布,而且原丝体丧失了干旱胁迫后正常复水的能力,进而导致细胞不能恢复正常的生理活动。因此认为,微管骨架在仙鹤藓原丝体适应干旱逆境的过程中起着重要作用。     

大鼠3′-甲基-4,4′-二甲基氨基偶氮苯(3′-MeDAB)诱癌过程甲胎蛋白的动态变化和免疫酶标记定位观察

本工作采用放射火箭电泳自显术和免疫酶标记定位技术,对大鼠3'-MeDAB诱癌过程血清和肝组织甲胎蛋白(AFP)的动态变化和定位情况进行了观察。发现(1)肝硬化假小叶内的少数肝细胞、嗜碱性间变再生结节细胞、少数“幸存肝细胞”及少数“过渡性细胞”,具有合成AFP的能力。未见肝内其他类型细胞合成AFP。合成AFP的细胞大多具有胞浆嗜碱性、生长活跃和形态上去分化的特点。(2)未见胆管癌细胞合成AFP。肝细胞癌分化好的癌细胞绝大多数也未见合成AFP,分化差的癌细胞合成AFP的能力,基本上与其生长活跃程度呈正相关,与分化程度呈负相关,而与癌细胞是否处于核分裂阶段关系不大。(3)肝癌组织AFP酶标的强度和范围与血清AFP水平之间基本上有平行关系。此外,本文还就什么细胞合成AFP、血清AFP“马鞍型”变化的成因及病理组织学基础等进行了讨论,并根据实验结果,对大鼠3'-MeDAB肝癌的组织发生提出了初步的设想。     

秋水仙素对小麦根尖细胞亚显微结构的影响

在不同浓度和处理时间下用秋水仙素处理小麦根尖,发现根尖分生区细胞的亚显微结构发生了程度不同的变化。表现在核占细胞体积的比例减小,形态变化多样;内质网由分散分布到形成订聚集体;原质体减少而淀粉质体增加;微体减少;液泡增大;细胞壁不均匀地加厚且细胞间隙增大等方面。初步讨论了秋水仙素引起的微管解聚是内质网、质体、微体、核等所处的状态和细胞壁不均匀加厚的主要原因。探测了秋水仙素对小麦根尖细胞亚显微结构影响     

RNA干扰技术体外抑制肝星状细胞表皮形态发生素表达及其对肝癌细胞迁移能力的影响

肿瘤微环境中肝星状细胞能够影响肝癌细胞的生物学行为.在肝脏发育过程中,肝星状细胞通过表皮形态发生素(epimorphin,EPM,syntaxin2)与肝干细胞接触而促进肝干细胞的功能性分化.EPM在溃疡性结肠炎、间质性肺炎以及结肠癌中也发挥了重要的作用.发现肝细胞癌(HCC)细胞能够促使星状细胞EPM表达上调.为了研究肝星状细胞的EPM对于肝癌可能的作用,构建了针对EPM基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染肝星状细胞,获得了两株携带该干扰片段的细胞系.RT-PCR与Westernblot检测结果表明,转基因干扰星状细胞系EPMmRNA和蛋白质表达量明显降低.之后,使用转基因细胞系的条件培养基对于肿瘤细胞进行侵袭能力的检测,并对星状细胞与肝癌细胞三维共培养,证明EPM干涉后肝星状细胞促进肿瘤细胞迁移的能力降低.结果表明通过RNAi可稳定干扰人肝星状细胞EPM基因的表达,并且EPM能够促进肝癌细胞的转移.     

2（4′噻唑）苯丙咪唑对猪脑微管蛋白体外聚合的影响

本研究利用猪脑中分离纯化的微管蛋白聚合和解聚反应,分析了具有争议的非整倍体诱发剂2（4′噻唑）苯丙咪唑（thiabendazole,TBZ）对微管蛋白聚合状态的影响。秋水仙素(colchicine)为本研究的阳性对照物。结果发现2（4′噻唑）苯丙咪唑能显著抑制体外微管蛋白的聚合,并呈明显的剂量效应关系。研究表明,TBZ可能通过抑制微管蛋白聚合来影响染色体正常分离,诱发非整倍体。     

天花粉蛋白对滋养层细胞专一损伤机制的研究

在体外培养条件下,天花粉蛋白胶体金以受体介导的内吞方式进入滋养层细胞和绒癌细胞,最终进入胞质溶胶着在核糖体上,经相同处理的肝癌细胞,绿猴肾细胞和正常鼠胚肝细胞,金颗粒既不与这些细胞表面结合,也没有被专一内吞的现象。分别用ＢＳＡ,转铁蛋白活化的胶体金处理滋养层细胞和绒癌细胞的方式与天花粉蛋白的结果相同,先以肝癌单抗处理也不影响天花粉蛋白的结果相同,先以肝癌单抗处理也不影响天花粉蛋白的肝癌单抗结合物进