肝癌细胞与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面粘附特性

本文以正常胎肝细胞的原代培养及肝癌细胞的传代培养为基础,应用微管吸吮技术在单个细胞水平上研究肝实质细胞癌细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力学特性。实验将正常原代肝细胞与肝癌细胞进行对照,阐明肝癌细胞与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面粘附行为的时间与浓度依赖性,结果表明肝癌细胞与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面具有更强的粘附力。这一研究对肝癌转移的定量研究有方法学的参考意义。     

肝癌细胞粘附和收缩调节对其Rho蛋白表达和迁移影响的实验研究

运用定量显微形态分析技术、免疫荧光实验技术和MTT分析法,分别对裱衬纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和应用肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)抑制剂ML-7作用下,肝细胞L02与肝癌细胞HepG2细胞骨架装配和Rho蛋白表达变化,以及细胞迁移能力进行检测和定量表征,了解肝癌细胞侵袭转移的胞内分子基础。结果显示：1)L02 Rho蛋白表达水平明显低于HepG2,裱衬FN低浓度（1～5 μg/mL）使 L02 Rho蛋白表达进一步下调,HepG2 Rho蛋白表达水平却明显增高,而裱衬 FN高浓度（10～40 μg/mL）L02Rho蛋白升高超过对照组,HepG2 Rho蛋白表达下降,且远低于对照组水平;2）随着裱衬FN浓度的增加,HepG2增殖抑制明显;3）裱衬低浓度FN使HepG2迁移运动能力增强,而高浓度FN使细胞净位移和迁移轨迹离散度减少;4）ML-7低浓度（6 μmol/L）使L02 Rho蛋白表达下调,而对HepG2 Rho蛋白表达无明显影响,L02细胞骨架解聚较HepG2明显;ML-7高浓度（10 μmol/L）HepG2Rho蛋白表达减少,且迁移速率降低;L02 Rho蛋白表达无进一步下调。说明：1)细胞粘附状态对调节HepG2 和L02Rho蛋白表达呈相反趋势;2)HepG2对骨架收缩抑制的响应较L02迟缓;3)HepG2Rho蛋白表达水平与其迁移能力呈正相关。     

integrin β1在不同细胞周期肝癌细胞与内皮细胞粘附中的作用

探讨了integrin β1在不同细胞周期人肝癌细胞(SMMC-7721)上的表达和在肝癌细胞与人脐静脉内皮细胞粘附过程中的作用.未同步处理的肝癌细胞(对照组)各细胞周期时相百分比为G0/G1期53.51%、G2/M期11.01%、S期35.48%,采用胸腺嘧啶脱氧核苷、秋水仙碱顺序阻断和胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养的方法获得G1期和S期的肝癌细胞,其同步率分别为74.09%和98.29%.G1期肝癌细胞integrin β1表达的荧光强度较S期和对照组相应值明显降低.利用微管吸吮技术定量研究了肝癌细胞与内皮细胞之间的粘附力学特性,发现G1期肝癌细胞的粘附力值比S期相应值明显降低(P＜0.01),而S期的粘附力值与对照组比较无明显差别,integrin β1在肝癌细胞与内皮细胞粘附过程中的贡献约50%.结果提示胸腺嘧啶脱氧核苷和秋水仙碱能较好地将肝癌细胞同步于G1期和S期,integrin β1在SMMC-7721肝癌细胞上的表达水平呈现周期差异,在肝癌细胞与内皮细胞粘附过程中,S期细胞可能起的作用更大,integrin β1在这一粘附过程中起着重要作用.     

肝癌细胞与内皮细胞的粘附力学特性研究

采用细胞同步技术和微管吸吮技术,从细胞周期的角度研究不同细胞周期肝癌细胞(hepatocellularcarcinoma cells,HCC)与脐静脉内皮细胞(HUVEC)的粘附力学特性。结果表明,未同步化肝癌细胞各周期时相的细胞百分比为:G_0/G_1期,53.51％;G_2/M期,11.01％;S期,35.48％。采用胸腺嘧啶脱氧核苷、秋水仙碱顺序阻断和胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养的方法可分别获得G_1期和S期的肝癌细胞,其平均同步率分别为69.02％和96.50％。G_1期肝癌细胞与人脐静脉内皮细胞的粘附力比S期相应值明显降低(P<0.01),与未同步化肝癌细胞组比较也得到同样结果,而S期与未同步化肝癌细胞组的粘附力值无明显差别。肝癌细胞与脐静脉内皮细胞的粘附力随着粘附时间的变化而变化,在30～60min内迅速增长,60min之后维持在较稳定的水平,即300×10~(10)N左右。提示:在肝癌细胞与内皮细胞的粘附过程中,S期细胞可能起的作用更大;肝癌细胞和内皮细胞上粘附分子表达呈现时间效应,从而体现出粘附和去粘附的行为特征。     

原子力显微镜研究粘附分子与细胞膜上整合素分子的相互作用

目的：研究肝癌细胞弹性变化对其表达的整合素分子与配体分子相互作用的影响。方法：以壳聚糖/ 聚丙烯酰胺水凝胶作为 可变基底材料,并将人肝肿瘤细胞（HepG2）接种到不同软硬度壳聚糖/ 聚丙烯酰胺水凝胶基底上,利用原子力显微镜力与距离模 式定量测定不同软硬基底上生长的HepG2 肝瘤细胞膜表面整合素分子与层粘连蛋白分子之间相互作用力。结果：功能化的原子 力显微镜探针与不同软硬基底上生长的细胞所产生的粘附情况不相同,细胞生长在培养皿的为对照组;细胞生长在硬度为1000 Pa 壳聚糖/聚丙烯酰胺水凝胶基底上的为实验组,表达在HepG2 肝瘤细胞膜上的alpha-6-beta-1 整合素与其配体层粘连蛋白相互作用力 的大小分别为19± 7 pN和38.85± 19.7 pN。结论：基底软硬度会影响细胞整合素与配体分子间的相互作用。     

苯胺嘧啶衍生物X-9通过下调整合素β1表达抑制肝细胞癌迁移侵袭

整合素在许多肿瘤细胞中高表达,并且参与肿瘤细胞的侵袭转移。在肝细胞癌中,整合素β1被报导高表达,并促进肿瘤细胞的侵袭。目前,对于整合素的表达调控癌细胞机制以及干预其表达进而抑制肿瘤细胞转移的研究较少。本研究探讨利用小分子化合物抑制整合素表达来抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的可能。首先,对临床肝癌细胞患者癌组织和癌旁组织中的整合素β1的表达进行检测,发现其在癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.05）。对TCGA肿瘤数据库的生物信息学分析结果同样显示,整合素β1的高表达与肝癌的分期（P=0.019）和预后（P=0.013）相关。通过筛选发现,苯胺嘧啶衍生物X09可以抑制肝癌细胞中整合素β1的mRNA和蛋白质的表达（P<0.01）。细胞划痕愈合实验和细胞穿孔实验结果显示,苯胺嘧啶衍生物X-9能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭（P<0.01）。进一步的研究证实,在肝癌细胞中外源表达整合素β1可以逆转X-9对肝癌细胞迁移和侵袭的抑制;而在敲低整合素β1的细胞中,X-9对细胞的迁移和侵袭的抑制被消除。因此,鉴定出苯胺嘧啶衍生物X-9可以通过下调整合素β1表达,进而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。     

苯胺嘧啶衍生物X-9通过下调整合素β1表达抑制肝细胞癌迁移侵袭

整合素在许多肿瘤细胞中高表达,并且参与肿瘤细胞的侵袭转移。在肝细胞癌中,整合素β1被报导高表达,并促进肿瘤细胞的侵袭。目前,对于整合素的表达调控癌细胞机制以及干预其表达进而抑制肿瘤细胞转移的研究较少。本研究探讨利用小分子化合物抑制整合素表达来抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的可能。首先,对临床肝癌细胞患者癌组织和癌旁组织中的整合素β1的表达进行检测,发现其在癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.05）。对TCGA肿瘤数据库的生物信息学分析结果同样显示,整合素β1的高表达与肝癌的分期（P=0.019）和预后（P=0.013）相关。通过筛选发现,苯胺嘧啶衍生物X09可以抑制肝癌细胞中整合素β1的mRNA和蛋白质的表达（P<0.01）。细胞划痕愈合实验和细胞穿孔实验结果显示,苯胺嘧啶衍生物X-9能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭（P<0.01）。进一步的研究证实,在肝癌细胞中外源表达整合素β1可以逆转X-9对肝癌细胞迁移和侵袭的抑制;而在敲低整合素β1的细胞中,X-9对细胞的迁移和侵袭的抑制被消除。因此,鉴定出苯胺嘧啶衍生物X-9可以通过下调整合素β1表达,进而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。     

整合素β1表达上调对肺癌细胞迁移和粘附能力的影响

目的:构建整合素β1的全基因表达载体,并探讨上调整合素β1蛋白表达对肺癌细胞生物学行为的影响.方法:根据GenBank数据库提供的整合素β1基因核苷酸序列,构建整合素β1的全基因表达载体,同时将空载体pCDNA3.1作为阴性对照.将载体转入感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组栽体.2种重组栽体转染非小细胞肺癌细胞株PC-9细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定株.荧光显微镜、Real-time RT-PCR、Western blot检测整合素β1的基因及蛋白水平的表达情况.细胞划痕试验和粘附试验比较整合素β1对细胞迁移、粘附能力的影响.结果:G418筛选出稳定转染整合素β1全基因表达栽体和空载体的细胞,分别命名为PC-9/D6和PC-9/PCD.荧光显微镜见满视野带绿色荧光的细胞,PC-9/D6细胞整合素β1的mRNA、蛋白表达明显高于对照的PC-9/PCD细胞及母细胞PC-9.划痕试验和粘附试验表明整合素β1过表达的细胞株的迁移和粘附能力明显提高.结论:成功转染并筛选出整合素β1过表达细胞株,整合素β1过表达的细胞株的迁移和粘附能力明显升高.     

整合素及其在胚泡植入中的作用

整合素是一类由α、β亚基构成的异二聚体粘附分子,能够与胶原蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白等细胞外基质组分相互作用,调节细胞粘附和通讯.作为双向传递分子,整合素通过“胞内→胞外”和“胞外→胞内”两种方式介导细胞信号传递.成功的植入是侵入性的胚泡和接受性的子宫内膜相互作用的结果,整合素能够调节胚泡滋养层与子宫内膜之间的细胞-细胞及细胞-细胞外基质相互作用,是“植入窗口”期子宫内膜接受性的标记分子.     

Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力及E-cadherin，COX-2表达的影响

目的:探讨Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力及钙粘附蛋白E(E-cadherin)、环氧化酶-2(COX-2)表达的影响。方法:体外培养肝癌细胞系(SMMC-7721、MHCC97H)、正常非肿瘤肝细胞系(HL-7702),Transwell小室用于测定细胞的迁移侵袭能力,Western blot蛋白印迹法用于测定Notch1、E-cadherin、COX-2蛋白的表达水平,并采用DAPT阻断Notch信号通路,比较肝癌细胞系与正常非肿瘤肝细胞系的迁移侵袭能力及肝癌细胞中E-cadherin、COX-2蛋白的表达水平的改变。结果:SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞的迁移能力强于HL-7702细胞,差异有统计学意义(P0.05);相比于HL-7702细胞,MHCC97H细胞、SMMC-7721细胞中的Notch1、COX-2表达水平均显著升高,E-cadherin的表达水平明显降低(P0.05);DAPT处理后,SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞发生迁移的能力均弱于对照组,差异有统计意义(P0.05);DAPT处理后,SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞内COX-2、Notch1的表达量明显降低,而E-cadherin的表达水平升高(P0.05)。结论:Notch信号通路参与肝癌细胞迁移过程,其机制可能与E-cadherin、COX-2的表达相关。     

A REINTERPRETATION OF THE ONTOGENY OF THE ASCOCARP OF SPECIES OF THE ERYSIPHACEAE

A study of four species of Erysiphaceae (Uncinula salicis, Podosphaera leucotricha, Erysiphe cichoracearum, and Microsphaera diffusa) revealed that the binucleate stages of the ascocarp are initiated in a similar manner to those of Diporotheca rhizophila Gordon & Shaw. The “appendages” developing on immature ascocarps are considered to be receptive hyphae. Appendages characteristic of mature ascocarps are produced much later. Lysis of certain centrum cells occurs, and asci are initiated from some of the remaining binucleate centrum cells. Resorption of centrum cells by the asci is supported by this investigation, corroborating Björling's earlier studies on Erysiphe graminis.