构建基因工程菌发酵产生维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸

从棒状杆菌ＳＣＢ３０５８克隆得到两个２,５－ＤＫＧ＾＊＊还原酶基因后,构建了两个能够表达２,５－ＤＫＧ还原酶的基因工程大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＥＴ９ａⅡ和ＤＨ５α（ｐＢＬ４）和一个基因工程欧文氏菌ＥＲ９７。２,５－ＤＫＧ还原酶基因分别受控于ＰＬ或Ｔ７启动子,通过加入ＩＰＴＧ或提高温度进行诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和酶活测定确定它们在诱导后得到了高表达,用细胞抽提液在加入辅酶ＮＡＤＰＨ的体外实验中转     

棒状杆菌2,5—二酮基—D—葡萄糖酸还原酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的克隆？…

从棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＳＣＢ３０５８）初步纯化得到两个２,５－二酮基－Ｄ－葡萄糖酸（２,５－ＤＫＧ）还原酶,在此基础上利用ＰＣＲ技术,以基因组ＤＮＡ为模板,扩增得到含有２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅰ基因的片段,定向连接到ＰＧＥＭ３Ｚｆ（＋并转化大肠杆菌ＤＨ５α,是到阳性克隆ｐＧＥＭ８１３。     

棒状杆菌2,5—DGK还原酶基因在欧文氏菌中的表达

将能够在大肠杆菌内高效表达棒状杆菌２,５－ＤＫＧ还原酶Ｉ基因的质粒ｐＢＬ４改造成为具有链霉素抗性的质粒ｐＢＬＳ,采用改进的感受态转化法将ｐＢＬＳ导入能够利用葡萄糖高产２,５－ＤＫＧ的欧文氏菌ＳＢ１２５中,通过提高温度诱导,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析２,５－ＤＫＧ还原酶Ｉ获得了高效表达,占菌体总蛋白的２２％,不形成包涵体。体外酶活测定结果表明表达的酶具有较高的活力。同时,通过凝胶活力染色发现了宿主欧文氏     

EB病毒胸苷激酶基因的定向克隆

采用异硫氰酸胍（ＧｕＳＣＮ）和硅藻从Ｂ９５－８细胞中快速抽摸板ＤＮＡ。根据ＥＢ病毒（ＥＢＶ）Ｂ９５－８株ＤＮＡ全序列及编码ＥＢＶ胸苷激酶（ＴＫ）的开放读框ＢＸＬＦ１的结构,设计合成一对引物,并在引物的５′一端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点,用ＰＣＲ技术扩增出一含完整的ＥＢＶＴＫ基因的１．８４３ＫｂＤＮＡ片段,ＮｃｏＩ酶切分析鉴定,ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切ＰＣＲ产物和载体,使目的基因定向克隆至选     

东亚钳蝎神经毒素在大肠杆菌中的表达

以山西风陵渡东亚钳蝎（ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉＫａｒｓｃｈ）的尾腺总ＲＮＡ为模板,根据已知的蝎神经毒素保守氨基酸序列设计引物,利用ＰＣＲ技术,扩增并克隆了两个蝎神经毒素基因．序列分析表明,由两个基因导出的氨基酸序列（ＢｍＫＭｍ１和ＢｍＫＭｍ２）与已知的蝎神经毒素ＢｍＫⅠ、ＢｍＫⅡ、ＢｍＫⅢ、ＢｍＫＭ１、ＢｍＫＭ９有很高的同源性．将ＢｍＫＭｍ２基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体ｐＥｘＳｅｃ１中进行表达．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物被分泌到细胞周间质及培养液中．经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化后的蛋白质注射小白鼠表明表达产物有生物学活性     

点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的高效表达

采用ＰＣＲ分段克隆法将点状产气单胞菌点状亚种（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｃｔａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｊｐｕｃｔａｔａ）脯氨酰内肽酶（ｐｒｏｌｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ,ａｐＰＥＰ）的编码区基因分成３段扩增并拼接成编码６９０个氨基酸的完整基因ａｐＰＥＰ,将其克隆在表达载体ｐＢＬ和ｐＫＫＨ上,构建成温度和ＩＰＴＧ诱导型高效表达ａｐＰＥＰ的重组大肠杆菌ＢＬ２１／ｐＢＬ－ＰＥＰ和ＢＬ２１／ｐＫＫＨ－ＰＥＰ     

双抗（抗病毒及抗虫）植物表达载体的构建及番茄的化鉴定

将抗病毒的ＣＭＶ－ｃｐ基因和抗虫的Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因依次插入到植物表达载体ＰＥ３的ＨｉｎｄⅢ和ＫｐｎⅠ位点,通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定,然后以土壤农杆菌ＧＶ３１１－ＳＥ介导转化番茄,胭脂碱检测,染色体ＤＮＡ的点杂交及ＰＣＲ扩增证明ＣＭＶ－ｃｐ基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因已同时导入转化再生的番茄植株。ＲＮＡ点杂交证明ＣＭＶ－ｃｐ基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因已在转基因番茄植株中同时获得表达。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段的克隆与颗粒体蛋白基因的定位

用ｐＵＣ１９质粒作载体,克隆了黄地老虎颗粒体病毒（Ａｇｒｏｌｉｓｓｅｇｅｔｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,简称ＡｓＧＶ）ＤＮＡＰｓｔＩ－Ｄ．Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｈ．Ｊ．Ｋ．等７个片段。以［￣（３２）Ｐ］－ｄＣＴＰ标记的油桐尺蠖核型多角体病毒（Ｂｕｚｕｒａｓｕｐｐｒｅｓｓａｒｉａｎｕｃｌｃａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ简称ＢｓＮＰＶ）多角体蛋白基因为探针,在３７℃条件下对ＡｓＧＶ）颗粒体蛋白基因进行了定位,将其分别定位于ＢｓｌⅡ－Ｓ或ＴＰｓＴＩ－Ａ或Ｂ和ＥｃｉＲＩ－Ａ片段上。     

D.radiodurans CatB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过生物信息学方法从耐辐射奇球菌（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）全基因组居库中查鼠并克隆了编码过氧化氢酶（Ｃａｒｔａｌａｓｅ,Ｃａｔ）的１６１１ｂｐ长ＣａｔＢ基因,将ＣａｔＢ基因连人ｐＫＫ２２３－３表达载体,转化Ｃａｔ酶链陷型大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＭ２）。转化菌裂解液ＰＡＧＥ酶活性染色分析实物具有Ｃａｔ酶活性,电泳过移位置与ＣａｔＢ位置相符。Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＣａｔＢ基因的表达可使Ｅ．     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)大立方形多角体突变株的分子生物学研究

利用空斑技术,从既能形成多角体又含ＴＫ酶基因的苜蓿丫纹夜蛾重组核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫ中,纯化了一株形成大立方形多角体的病毒突变株ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫｍｔ５１３。用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＢｇｌⅡ及ＫｐｎⅠ等限制性内切酶对它做了酶切分析,并克隆了多角体蛋白全基因及其侧翼部分的片段。对所克隆的部分全序列测定结果,发现在多角体蛋白基因读码框内只出现了一个碱基的突变,导致了第２５位的氨基酸密码子由ＧＧＴ变为ＧＡＴ,该位氨基酸由甘氨酸（Ｇｌｙ）变为天冬氨酸（Ａｓｐｑ）还利用ＰＣＲ技术扩增出突变了的多角体蛋白基因部分片段,并将它克隆入转移载体质粒ｐＥＶ５５,与不形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＨＢｓＤ４ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,结果产生同样的大立方形多角体病毒。     

人表皮生长因子（EGF）与单核—巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）融合？…

应用基因工程技术,将ＥＧＦ,ＧＭ－ＣＳＦ基因克隆到ｐＧＥＭ－３Ｚｆ载体的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,再钭重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０扔ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明ＥＧ－ＦＧＭ－ＣＳＦ融全蛋白获得表达,并且具有ＥＧＦ,ＧＭ－ＣＳＦ免疫学活活。     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

汉滩病毒核壳蛋白（NP）在杆状病毒系统的表达及其免疫原性研究

应用杆状病毒表达载体成功地表达了汉滩病毒７６－１１８株（ＨＴＮＶ）核壳蛋白,将ＨＴＮＶＳ基因插入杆状病毒转染质粒ｐＡｃＹＭＩＢ的多角体基因启动子下游附近,与经Ｂｓｕ３６１酶切线性化的杆状病毒（ＡｃＶＥＰＡ）ＤＮＡ共同转染Ｓ１９细胞,经空斑筛选获得了高效表达ＮＰ的重组杆状病毒（ＡｃＶＨａｎＳ）。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实,表达产物与ＨＴＮＶ毒粒ＮＰ分子量均为５０ＫＤ左右,紫外扫     

人表皮生长因子(EGF)与单核-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合蛋白在大肠杆菌中的表达

应用基因工程技术,将ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ基因克隆到ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）载体的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明ＥＧＦ－ＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白获得表达,并且具有ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ的免疫学活性．这为进一步研究该融合蛋白的功能和肿瘤治疗提供一种新的基因产品．     

蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ扩增我国蓝舌病毒Ｚ１株的ＶＰ７基因,直接将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的重组质粒,用ＤＩＧ标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交,证明插入片段为ＢＴＶ ＶＰ７基因特异性片段。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的９株蓝舌病毒及相关的环状病毒的ＶＰ７基因进行了比     

点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶基因克隆与序列测定

点状产气单胞菌点状亚种（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｎｃａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｐｕｎｃｔａｔａ）具有脯氨酰内肽酶（ｐｒｏｌｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＰＥＰ）活性。将其染色体ＤＮＡ有Ｅｃｏ ＲⅠ部分酶切后回收８－１６ｋｂ的ＤＮＡ片段,与ＥｃｏＲⅠ消化载体ｐＵＣ１８连接后转化Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＨ５α,用该酶的专一性底物Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－Ｇｌｙ－β－ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ从质粒库中     

双抗(抗病毒及抗虫)植物表达载体的构建及番茄的转化鉴定

将抗病毒的ＣＭＶ－ｃｐ 基因和抗虫的Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因依次插入到植物表达载体ｐＥ３ 的ＨｉｎｄⅢ和ＫｐｎⅠ位点,通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定,然后以土壤农杆菌ＧＶ３１１－ＳＥ介导转化番茄,胭脂碱检测,染色体ＤＮＡ 的点杂交及ＰＣＲ扩增证明ＣＭＶ－ｃｐ 基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因已同时导入转化再生的番茄植株。ＲＮＡ 点杂交证明ＣＭＶ－ｃｐ 基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ 基因已在转基因番茄植株中同时获得表达。     

畲族Gc、PGM1、AcP_1、6-ΡGD、ADA和AK1的遗传多态性

对畲族血浆组特异性成分（Ｇｃ）、红细胞磷酸葡萄糖变位酶１（ＰＧＭ１）、酸性磷酸酶（ＡｃＰ１）、６－磷酸葡萄糖酸脱氢酶（６－ＰＧＤ）、腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）、腺苷酸激酶（ＡＫ１）的遗传多态性进行了研究。Ｇｃ与ＰＧＭ１是用薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析的,ＡｃＰ１、６－ＰＧＤ、ＡＤＡ及ＡＫ１是用淀粉凝胶电泳分析的。各基因座的基因频率分别为Ｇｃ＊１Ｆ０．４７２２、Ｇｃ＊１Ｓ０．２４２１、Ｇｃ＊２０．２７３８;ＰＧＭ１＊１Ａ０．５３５７、ＰＧＭ１＊１Ｂ０．１６２７、ＰＧＭ１＊２Ａ０．１５８７、ＰＧＭ１＊２Ｂ０．１４２９;ＡｃＰ＊１Ａ０．１８２５、ＡｃＰ１＊Ｂ０．８１７５;６－ＰＧＤ＊Ａ０．９６８３、６－ＰＧＤ＊Ｂ０．０２７８;ＡＤＡ＊１０．９８８１、ＡＤＡ＊２０．０１１９;ＡＫ１＊１１．００００。畲族Ｇｃ、ＰＧＭ１、ＡｃＰ１、６－ＰＧＤ和ＡＤＡ基因为多态,而ＡＫ１基因为单态。发现１例带有６－ＰＧＤ＊Ｒ和３例带有Ｇｃ＊１Ａ２变异等位基因的个体,其中Ｇｃ＊１Ａ２基因频率为０．０１１９,达到多态水平。     

马立克氏病病毒（MDV）814株B抗原基因的克隆及部分序列分析

提取感染鸡胚成纤维细胞ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４病毒ＤＮＡ为模板,根据ＲＢＩＢ株ｇＢ基因５′及３′两端核苷酸离列设计引物,利用ＰＣＲ技术扩增了我国ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４ｇＢ基因（２．９ｋｂ）将扩增片段平末端克隆到载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中ＥｃｏＲＶ位点,经ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄＩＩＩ酶切鉴定得到不同插入方向的重组质粒。构建圹增片段的酶切图谱及部分序列分析证明与ＲＢＩＢ株ｇＢ基因无差异,显示了极高的     

表达流行性感冒病毒血凝素蛋白的重组腺病毒的构建

用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增流感病毒血凝素基因,将其克隆到５型腺病毒载体质粒ｐＡＤ５Ｃ中。用此质粒与ＥｃｏＲＩ酶切回收的５型腺病毒基因组片段共转染２９３细胞,通过ＰＣＲ初步筛选得到重组病毒。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ重组病毒能表达流感病毒的血凝素蛋白。此重组病毒经滴鼻免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ实验证明能诱导小鼠产生针对流感的循环抗体ＩｇＧ和分泌型抗体ＩｇＡ。本实验证明,利用Ｅ