GWAS研究大肠杆菌和金黄色葡萄球菌种间互作进化机制

【目的】通过实验室培养模拟自然环境微生物相互作用,进而找到影响细菌基因型和表型的基因。【方法】将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在实验室条件下进行单独培养和两两混合培养并连续转接,通过得到的数量表型与最大生长速率表型做全基因组关联分析(GWAS),对得到的与表型相关的SNP进行注释与分析。【结果】162个SNP位点影响到大肠杆菌原始菌株与共培养菌株的生长,36个SNP位点影响大肠杆菌菌株在单独培养和共同培养的生长。总共有85个SNP位点影响金黄色葡萄球菌的原始菌株与单独培养。其中5个基因在之前文献中已有报道。对影响不同时间点细菌数量变化形状的SNP位点进行功能注释,大肠杆菌中有706个与生长性能相关。金黄色葡萄球菌中,129个和不同的生长性能相关。大肠杆菌SNP位点的13个基因在之前的研究中已有报道。【结论】混合培养和单独培养都检测到与生长相关的显著基因,本研究表明了GWAS在研究细菌互作进化机制方面的潜力。     

功能作图(functional mapping)分析大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之间的竞争互作

【背景】功能作图(functionalmapping)模型是基于统计方法的分析生物体动态复杂性状发育的全基因组作图方法,旨在定位性状发育过程中的数量性状位点(quantitative trait loci, QTL),将功能作图应用于微生物研究有助于解析复杂的互作过程。【目的】利用功能作图定位两种微生物在动态生长发育过程中发挥显著作用的QTL,通过基因功能注释找到影响微生物表型生长的基因。【方法】将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各100个菌株单独培养和一一配对共同培养,将取得的各菌株生长丰度表型数据和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)数据进行关联分析,找到同一物种在不同培养条件下对生长起作用的显著QTL。【结果】通过功能作图分析,在大肠杆菌中定位到217个QTL,金黄色葡萄球菌中定位到152个QTL;通过功能聚类和基因注释分析发现,QTL所在候选基因中金黄色葡萄球菌scdA、sdrC、sdrD、ftsA和大肠杆菌phr、nagC、eptA、ppsA、priA、flim基因对微生物的生长发挥了较大作用。【结论】本文借助功能作图定位了大肠杆菌和金黄...     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因(nos)缺失突变株的构建

目的：构建金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因（nos）缺失突变株。方法从金黄色葡萄球菌RN6390的基因组DNA中扩增了nos基因的上、下游片段;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌穿梭质粒pMAD（含有温度敏感性的复制起点,红霉素抗性基因（erm）和B．半乳糖苷酶基因（bgaB）为筛选标记）为骨架,构建基于nos基因位点的同源重组载体pMADAnos,该载体经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再转入金黄色葡萄球菌RN6390。经过在30℃和42℃交替培养,通过抗生素抗性和β-半乳糖苷酶活性筛选nos基因缺失突变株。结果筛选得到的突变菌株,经基因组PCR、定量PCR及序列分析表明,金黄色葡萄球菌RN6390基因组中的nos基因被成功地敲除。结论利用同源重组的方法构建了金黄色葡萄球菌RN6390nos缺失突变株,为金黄色葡萄球菌nos基因功能的研究奠定了基础,     

利用系统作图(Systems mapping)研究大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的互作遗传机制

【背景】物种间相互作用是物种进化的重要推动力,然而如何将基因型和表型关联以及确定在物种相互作用过程中起重要作用的基因均面临挑战。【目的】通过系统作图(Systems mapping)得到两种微生物在相互作用过程中起重要作用的SNPs (Single nucleotide polymorphism),以及随着时间的变化,这些SNPs是如何相互联系进而影响大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的相互作用。【方法】分别对45株大肠埃希菌、45株金黄色葡萄球菌进行单独培养和混合共培养,通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)进行绝对定量,得到一定时间内各个菌株的生长量,比较相同菌株在不同培养条件下生长情况,以各个菌株重测序结果为基础,结合系统作图得到在相互作用过程中起重要作用的显著SNPs及其相互联系。【结果】通过系统作图分析,获得具有54对显著SNPs组合的三维曼哈顿图,这些组合中41个显著SNPs来自大肠埃希菌,12个显著SNPs来自金黄色葡萄球菌。在上述SNPs中已有6个SNPs所在的候选基因都可以直接或者间接影响微生物的生长量变化,从而影响两种微生物相互作用方式。它们分别是nhaR(E19056)参与生物膜的形成,rhlE(E832164)与核糖体的组装有关,csiD (E2789300)的表达可以使细胞面对恶劣环境,alk B (E2309274)可以参与DNA的损伤修复,sucA(E759230)和yjjW(E4614704)都参与细胞的代谢过程。【结论】系统作图可以检测到物种在相互作用过程中显著SNPs;物种相互作用过程中不同SNPs遗传效应随着时间变化;细菌的相互作用过程是直接遗传效应、间接遗传效应和上位性效应共同产生的结果。     

基于简化基因组测序的大黄鱼耐高温性状全基因组关联分析

利用Illumina HiSeqTM 2500测序平台, 对通过高温胁迫实验筛选得到的20尾耐高温和20尾不耐高温的大黄鱼(Larimichthys crocea)进行了简化基因组测序(SLAF-seq), 每个样本的平均测序深度达到10.26×, 共获得419211个高质量的群体单核苷酸多态性(SNP)位点 。利用TASSEL软件的混合线性模型(MLM)进行全基因组关联分析(GWAS), 共筛选到38个与大黄鱼耐高温性状显著相关的SNP位点(P<2.39E–08)。利用BLAST程序定位每个SNP位点在大黄鱼基因组中的位置, 并分析其周围的功能基因。结果在38个SNPs附近共找到26个已知的功能基因, 这些基因主要与细胞转录、代谢、免疫等功能相关。研究结果可为下一步大黄鱼耐高温分子机制解析及耐高温品种的选育提供参考。     

高粱株高相关基因SbPH11分子标记的开发和应用

生物量是饲用高粱的重要性状,株高与生物量呈正相关性。本研究以237份高粱自交系关联群体为材料,筛选到株高关联基因SbPH11的两个功能性SNP位点,两个SNP位点组合的单倍型共3种：SbPH11-Hap1、SbPH11-Hap2和SbPH11-Hap3,SbPH11-Hap2所对应的高粱材料的株高极显著高于SbPH11-Hap1和SbPH11-Hap3所对应的高粱材料的株高,SbPH11-Hap1的高粱材料株高极显著高于SbPH11-Hap3的高粱材料株高。针对SbPH11的两个功能性SNP位点开发了KASP分子标记,利用该标记对30份高粱种质资源进行了基因分型和表型验证,结果证实开发的KASP分子标记可以准确地鉴定出SbPH11两个功能性SNP位点的基因型。该KASP分子标记可高效准确地预测不同高粱种质资源的株高类型,可应用于高粱株高的早期筛选和分子标记辅助选择育种。     

小麦耐低磷相关性状的全基因组关联分析

通过对小麦耐低磷相关性状进行全基因组关联分析(GWAS,genome-wide association study),挖掘与小麦耐低磷性显著相关的单核苷酸多态性标记(SNP,single nucleotide polymorphism)位点及候选基因,为小麦耐低磷性状的遗传基础和分子机制研究提供理论参考。本试验以198份黄淮麦区小麦品种(系)为试验材料,设置低磷和正常磷营养液水培试验,利用小麦35K芯片对分布于小麦全基因组的11896个SNP,采用Q+K关联模型对小麦耐低磷性相关性状进行关联分析。结果表明,小麦耐低磷性状表现出广泛的表型变异,变异系数为15.65%~26.59%,多态性信息含量(PIC,polymorphic information content)为0.095~0.500。群体结构分析表明,试验所用自然群体可分为2个亚群,GWAS共检测到67个与小麦耐低磷相关性状显著关联的SNP位点(P≤0.001),这些位点分布在除3A、3B和3D以外的18条染色体上,单个SNP位点可解释5.826%~9.552%的表型变异。在这些显著位点中有4个SNP位点同时关联到了2个不同的耐低磷性状。对67个SNP位点进行发掘,筛选到7个可能与小麦耐低磷性有关的候选基因。TraesCS6A02G001000和TraesCS6A02G001100在锌指合成中有重要作用;TraesCS6A02G118100可能为低磷胁迫诱导基因;TraesCS5D02G536400、TraesCS1B02G154200和TraesCS5D02G536500与低磷胁迫相关酶类基因家族有关;TraesCS1D02G231200与植物DUF 538结构域蛋白有关,是植物胁迫相关调控蛋白候选基因。     

甘蓝型油菜籽粒着生密度及其相关性状全基因组关联分析

油菜角果内籽粒着生密度影响每果粒数,对油菜产量有直接或间接影响。本研究以不同遗传背景和地理来源的213份甘蓝型油菜品种(系)构成的自然群体为研究对象,利用芸薹属60 K Illumina Infinium SNP芯片进行群体结构、亲缘关系以及连锁不平衡分析;然后基于最优模型对籽粒着生密度及其相关性状进行全基因组关联(GWAS)分析。通过GWAS分析,共检测到10个SNP位点与籽粒着生密度及其相关性状关联。其中与籽粒着生密度关联的标记有2个,表型贡献率分别为9.49%和11.17%;与角果有效长关联的标记有6个,单个位点可解释9.81%~12.17%的表型变异;与每果粒数相关联的标记有2个,分别解释10.44%和10.87%的表型变异。通过分析关联SNP位点的LD区间的基因信息,筛选出16个与籽粒着生密度及其相关性状有关的候选基因,其中KMD4和UGT76C2基因与细胞分裂素的调控有关;AGL104和ADC2基因参与种子的形成过程;MCCB、NGA2和MATE等基因参与侧生器官的生长发育过程,它们的异常表达会导致一些侧生器官的变异。ADC2和UGT76C2两个候选基因可能对籽粒着生密度和每果粒数一因多效性。     

甘蓝型油菜每角果粒数全基因组关联分析

为挖掘甘蓝型油菜每角果粒数显著关联单核苷酸多态性（SNP）位点及相关候选基因。本研究以300份甘蓝型油菜自交系为试验材料,对甘蓝油菜每角果粒数进行一年两地表型考察,并结合该群体前期开发的201 817个SNPs标记,采用一般线性模型（GLM）和混合线性模型（MLM）进行全基因组关联分析（GWAS）,此外,对性状显著关联SNP位点两侧100 kb区域内相关候选基因进行功能预测。300份甘蓝型油菜每角果粒数在两地均表现出广泛的表型变异,筛选出2份每角果粒数较多的油菜种质资源。基于GLM模型检测到39个与油菜每角果粒数显著关联SNPs,采用MLM分析发现,两地共检测到的3个每角果粒数显著关联SNPs位点均在GLM检测到。8个位点附近找到CIK,ERF022和EDE1等19个拟南芥已报道角果籽粒发育相关的同源基因。研究结果有助于解析甘蓝型油菜每角果粒数的遗传基础,为研究每角果粒数的调控机制、指导每角果粒数的遗传改良奠定基础。     

中国汉族高原肺水肿易感基因的全基因组关联研究

高原肺水肿(High-altitude pulmonary edema, HAPE)是一种特发于高原低氧环境的肺水肿, 是遗传和环境因素共同作用的结果。为了寻找与中国汉族高原肺水肿相关的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)位点及易感基因, 文章利用Affymetrix SNP Array 6.0芯片, 对2010年5月至2012年7月在青海省玉树地区执行援建任务时来自平原地区的40例HAPE患者和33例健康对照进行全基因组SNP分型, 通过PLINK软件对芯片结果进行全基因组关联分析(Genome-wide association study, GWAS), 筛选出在病例组和对照组中间有显著差异(P < 10E-7)的SNP位点57个, 通过对57个SNP位点附近74个基因进行GO与Pathway富集分析, 发现这些基因与“前列腺素代谢”、“四烯酸代谢”、“氮代谢”显著相关(adjust P < 0.05), 以上代谢过程与HAPE病理生理机制相关。结果表明, 高原肺水肿受遗传多态性影响, 与多个基因以及位点相关。     

表型可塑性变异的生态-发育机制及其进化意义

表型可塑性赋予生物个体在不同环境条件下通过产生不同表型来维持其适合度的能力.研究结果显示多数可塑性变异的产生是基于对环境变异信号的响应、改变基因表达式样并调整发育轨迹的结果,表观遗传调控体系在基因选择性表达和可塑性变异的跨世代传递过程中发挥了重要作用.不同物种和种群对环境变化的敏感性、发生可塑性变异的能力以及可塑性反应模式不尽相同,预示着控制可塑性能力并独立于控制性状的可塑性基凶的存在,这些基因是直接响应环境信号并控制表型表达的调控基因.表型可塑性不仅是物种适应性进化的一个重要方面,也是选择进化的产物,物种的表型可塑性变异对其生态适应和进化模式有深远的影响.     

金黄色葡萄球菌sdhCAB操纵子影响持留菌形成机制的研究

持留菌是细菌群体中的一小部分细菌,可耐受致死浓度抗生素的处理,是引起慢性感染的重要原因。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)作为常见致病菌,有重要临床意义。分别敲除sdhA和sdhB后,金黄色葡萄球菌持留菌形成水平下降,但sdhCAB操纵子对持留菌形成的作用及机制尚不明确。本研究敲除sdh操纵子,通过酸压力、氧化压力、热压力及抗生素压力实验检测敲除株的持留菌水平,转录组测序检测敲除株的代谢通路变化,高通量微生物细胞表型检测评估敲除株的代谢水平变化。结果显示,敲除sdhCAB或sdhAB后,金黄色葡萄球菌对酸压力、氧化压力的耐受能力均下降;而在抗生素压力、热压力条件下,分别仅sdhCAB敲除株、sdhAB敲除株耐受能力下降。转录组测序发现,sdhCAB敲除后三羧酸循环、甲烷代谢通路及聚合酶Ⅳ等基因表达上调,耐药相关基因、氨基酸代谢基因、糖类代谢基因、卟啉代谢基因及一些转运体基因等表达下调,提示这些通路的基因参与sdhCAB影响持留菌形成的过程。此外,高通量微生物细胞表型检测发现,敲除sdhCAB可降低金黄色葡萄球菌对琥珀酸、柠檬酸、糖原、L-天冬氨酸等64种碳源的代谢。结果提示,sdhCAB操纵子对金黄色葡萄球菌持留菌形成水平有重要影响。本研究初步阐明了sdhCAB操纵子影响持留菌形成的可能机制,为研究和治疗金黄色葡萄球菌慢性感染提供了新的思路。     

基于SNP 互作识别潜在冠心病致病基因

目的:基于全基因组关联分析(Genomewideassociationstudy,GWAS)数据与生物信息学方法,识别冠心病潜在致病基因。方法:利用生物信息学方法和GWAS数据,对单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms,SNP)进行疾病风险打分,依据特定距离阈值内的SNP-SNP互作关系,筛选出疾病相关SNP显著风险模块,识别潜在致病基因。结果:设定阈值20kb,经筛选获得279个SNP显著风险模块,映射到79个基因,文献验证率为71.01%。结论:基于SNP互作识别的潜在致病基因,能更加准确的分析冠心病的发生发展过程。     

文蛤HDAC1基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探索HDAC1基因在文蛤生长发育中的作用, 研究通过已构建的文蛤转录组文库, 利用SMARTRACE技术扩增得到文蛤HDAC1 (Mm-HDAC1)基因的cDNA全长序列, 分析了其生物信息学、组织及发育阶段表达特征, 并用直接测序法在外显子中筛查生长相关的SNP位点。结果显示, Mm-HDAC1基因的cDNA全长3065 bp, 开放阅读框1599 bp, 编码532个氨基酸; 氨基酸序列比对发现, 文蛤与其他物种同源性为74.3%78.7%。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明, Mm-HDAC1基因在文蛤6个组织中均有表达, 其中外套膜中的表达量相对最高, 并与其他组织间有极显著差异(P0.01); 不同发育时期的表达差异结果表明, Mm-HDAC1基因在壳顶幼虫期表达量最高, 显著高于其他发育时期(P0.05)。SNP位点筛查结果表明, 在Mm-HDAC1基因的外显子区域发现了19个SNP位点, 其中有3个SNP位点(627AT、924TC和1266TC)与文蛤生长相关。     

血浆凝集降低筛选金黄色葡萄球菌促凝相关基因

【背景】金黄色葡萄球菌是重要的致病菌,其中促凝聚是重要的致病机制之一,可能存在新的基因参与其中。【目的】通过采用血浆凝集降低方法筛选及鉴定促凝相关基因。【方法】利用转座子随机插入突变技术建立金黄色葡萄球菌转座子突变文库,采用动态比浊及试管凝集技术筛选凝集能力降低的突变株;应用抗性标记挽救法鉴定突变基因并应用生物信息学预测基因的功能。【结果】通过观察血浆凝集能力降低共计筛选到突变菌株82个。鉴定其中的76个突变菌株的转座子插入位点,涉及基因13个,包括报道的与促凝集有关基因4个(占筛选基因的30.8%)。【结论】从金黄色葡萄球菌凝集能力降低筛选与促凝集可能有关的基因,为金黄色葡萄球菌促凝集基因的筛选提供了新策略,同时为了解该菌促凝集过程提供了候选基因。     

复杂疾病的遗传易感基因区域的精细定位

以单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism, SNP)为遗传标记, 采用全基因组关联研究(Genome-wide association studies, GWAS)的策略, 已经在660多种疾病(或性状)中发现了3800多个遗传易感基因区域。但是, 其中最显著关联的遗传变异或致病性的遗传变异位点及其生物学功能并不完全清楚。这些位点的鉴定有助于阐明复杂疾病的生物学机制, 以及发现新的疾病标记物。后GWAS时代的主要任务之一就是通过精细定位研究找到复杂疾病易感基因区域内最显著关联的易感位点或致病性的易感位点并阐明其生物学功能。针对常见变异, 可通过推断或重测序增加SNP密度, 寻找最显著关联的SNP位点, 并通过功能元件分析、表达数量性状位点(Expression quantitative trait locus, eQTL)分析和单体型分析等方法寻找功能性的SNP位点和易感基因。针对罕见变异, 则可采用重测序、罕见单体型分析、家系分析和负荷检验等方法进行精细定位。文章对这些策略和所面临的问题进行了综述。     

norD对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响

目的探究norD编码的超家族转运蛋白NorD对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。方法使用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MW2野生株和norD基因缺失株及norD互补菌株,微孔法培养形成生物膜,同时使用番红染剂对形成的生物膜染色,通过酶标仪检测特定波长下的A值,对细菌生物膜形成定量分析。结果常规培养时,MW2野生株和MW2 norD缺失株生物膜的形成比较差异无统计学意义(P0.05)。低Fe~(2+)离子环境下,MW2 norD基因缺失株培养48h,生物膜形成的量少于MW2(t=3.878,P=0.0082)。结论MW2 norD基因缺失株在低Fe~(2+)离子环境下引发生物膜分解,提示NorD可促进Fe~(2+)离子环境下生物膜的形成。     

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220△nuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失.研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2莫玭uc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株.经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220△nuc1.     

小麦根部耐盐性状全基因组关联分析

为了解小麦耐盐相关性状的遗传机理,挖掘与小麦耐盐性显著相关的SNP位点及候选基因,本研究利用浓度200 mmol/L的NaCl溶液和正常营养液对全国300份小麦品种(系)进行耐盐性试验,并利用小麦90 K芯片对分布于小麦全基因组的16650个SNP,采用Q+K关联混合模型对小麦最长根长、根干重、根鲜重、根平均直径、根尖数、根表面积、根体积和总根长等8个根部耐盐性相关性状进行全基因组关联分析(GWAS,genome-wide association study)。研究结果表明,小麦根部性状表现出广泛的表型变异,变异系数为24.3%~50.0%,多态性信息含量(PIC,polymorphic information content)为0.170~0.562,全基因组LD衰减距离为6 Mb;群体结构分析表明,试验所用300份小麦品种(系)可分为3个亚群,亚群1包含143个(47.67%)试验材料,主要来自河南、陕西和四川;亚群2包含74个(24.67%)试验材料,主要来自北京;亚群3包含83个(27.67%)试验材料,主要来自河南。GWAS共检测到77个与小麦耐盐相关性状显著关联的SNP位点(P≤0.001),这些位点分布在小麦除6D外的20条染色体上,单个SNP位点可解释3.70%~19.45%的表型变异,其中位于1A、3A、4A、7A、3D和5D染色体上的RAC875_c13169_459等6个位点同时关联到2个或2个以上性状,贡献率为3.78%~19.45%;对77个SNP位点进行发掘,筛选到17个可能与小麦耐盐性有关的候选基因。TraesCS5B01G031800(阳离子反转运蛋白)在Na+等阳离子转运中起重要作用,TraesCS5A01G329000(防御素)可以在阻断Na+等阳离子进入过程中起作用,TraesCS2A01G079000(重复富脯氨酸细胞壁蛋白)在细胞壁的形成中起重要作用,这些候选基因可作为耐盐性重要基因。     

MRSA中mecA及femB基因的检测与耐药相关性

研究femB、mecA基因在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的表达与耐药的关系.运用PCR对MRSA的femB、mecA基因进行检测,MRSA耐药检测采用头孢西丁纸片法.40 株金黄色葡萄球菌(下简称金葡菌)通过头孢西丁纸片法,检出 30 株耐头孢西丁的菌株,通过PCR检测这 40 株金葡菌mecA基因,30 株MRSA全部为阳性, femB基因在 30 株MRSA中全部表达,而甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的未表达.结果可见,PCR能快速准确地鉴定MRSA, mecA基因是MRSA的耐药基因,femB基因是MRSA的耐药相关基因.