LASS1基因克隆及其在大鼠脑皮层的表达与神经元衰老的相关性初步研究

长寿保障基因LAG1是从酵母中克隆的与酵母寿命相关的基因,随酵母生命衰老而表达发生变化. 对大鼠中同源基因LASS1进行克隆、测序和序列分析,发现其mRNA序列不同于GenBank中的预测序列,开放阅读框包含1 053碱基对,编码蛋白由350个氨基酸组成,内含Lag1蛋白家族保守的Lag1p motif和TLC结构域. 从新生、1月龄、6月龄、12月龄和24月龄大鼠脑顶叶皮质提取总RNA,用半定量RT-PCR及RNA印迹方法对LASS1在大鼠脑皮质中的表达随年龄变化情况进行分析. 结果表明,出生后LASS1表达量随年龄增加而增高,至6月龄达高峰,然后随年龄增加而逐渐下降,至24月老龄鼠达最低. 衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)对鼠脑皮层染色发现,神经元阳性染色随年龄增长明显增加. 大鼠LASS1基因表达在正常衰老过程中发生变化,为进一步研究该基因的作用奠定了基础.     

线虫体内新piRNA研究

PIWI-interacting RNAs(piRNA)是一类內源性小RNA,负责抵御转座子和转基因对基因组的入侵.已发现1.6万多种piRNA,在piRNA上游存在保守序列,根据上游序列特征可以预测新的piRNA.将线虫同步化培养至L4时期,分别提取野生和prg-1突变样本中的小RNA,并对其进行高通量测序.基于piRNA上游保守序列特征,在野生线虫L4时期中,发现了967种新piRNA,这些新piRNA在prg-1突变后表达消失.新piRNA的基因座集中分布在四号染色体的2个piRNA簇内,首位碱基以U为主.与已发表的成虫发育时期的PRG-1免疫共沉淀数据比对,发现有153种piRNA存在于与PRG-1免疫沉淀的数据中.同时还发现一些只在野生线虫中表达的non-21nt小RNA,它们与已知piRNA的基因座相同,推测这些non-21nt小RNA可能是其piRNA前体加工的产物.总之,通过小RNA测序,在线虫中发现了一些新的piRNA.     

RNA干扰ABCE1基因后可增加肺癌95-D/NCI-H446细胞的E-钙黏附蛋白表达并减低细胞侵袭力

研究ABCE1对肺癌(95-D和 NCI-H446)细胞的作用．使用RNA干扰技术,抑制ABCE1基因的表达,通过Western blot 分析及FACS检测,观察ABCE1基因对E-钙黏附蛋白在95-D/NCI-H446细胞表达的影响;运用transwell 侵袭实验,观察M95-D/ NCI-H446细胞侵袭力的变化．RNA干扰ABCE1基因后,实验组与对照组相比,在48 h后可显著抑制肺癌(95-D和 NCI-H446)细胞ABCE1蛋白的表达,同时,伴随E-钙黏附蛋白的高表达,以及细胞侵袭力的降低． ABCE1基因与E-钙黏附蛋白相关,抑制ABCE1基因可增加肺癌95-D/NCI-H446细胞的E-钙黏附蛋白的表达,减低细胞的侵袭力．     

OsPDR在酵母中异源表达增强了酵母对钴的耐受性

在通过RNA-Seq技术得到的镉响应转录组图谱中,用50 μmol/L Cd处理24 h后,一个镉响应金属离子转运蛋白OsPDR被鉴定出其在水稻(Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare)茎中的表达量显著上调．本研究中,从水稻(Oryza sativa cv. Nipponbare)中分离了OsPDR基因,并对其金属离子转移活性进行了分析．金属耐受性实验结果表明,过表达OsPDR能提高酵母对Co的耐受性,但对Zn、Ni和Cd的耐受性不强,并且经电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定Co含量后,与空载体转化酵母相比,过表达OsPDR的酵母中Co的积累更高．利用共聚焦显微镜观察发现,EGFP-OsPDR融合蛋白定位于液泡膜上．这些数据表明OsPDR可能在Co稳态中起着重要作用．OsPDR在植物中的作用,还需要进一步的研究．     

BHC80基因抑制对斑马鱼胚胎红细胞发育的影响

胚胎整体RNA原位杂交显示,BHC80基因表达主要集中在中枢神经系统部位． 应用吗啡啉修饰的反义寡核苷酸技术抑制BHC80基因表达,显示胚胎红细胞减少并堆积在PBI区,用胚胎期红细胞标志βe3 globin以及造血过程中的重要转录因子gata1、c-myb、lmo2的胚胎整体RNA原位杂交实验显示,BHC80基因表达下调使gata1标记胚胎红系前体细胞增殖增多并且分化延迟,导致红细胞减少和PBI区红细胞堆积． 血管内皮标志基因flk-1的RNA探针原位杂交和荧光显微造影显示,BHC80基因表达下调组血管与对照组相比清晰可见无明显差异．     

鼠mPC-1基因的克隆与特性分析

为深入研究人前列腺癌相关基因PC-1的生物功能和进化保守状况,从小鼠肾脏中克隆了全长cDNA序列,命名为mPC-1（GenBank Acc No.AY048852）.mPC-1基因cDNA全长为2 193 bp,主要定位于小鼠染色体3A1-A2区域.mPC-1基因最大开放阅读框编码的蛋白质由224个氨基酸组成,与人PC-1蛋白编码区存在82%的序列一致性,含有coiled-coil结构域和PEST结构域.生物信息学分析表明,由6个外显子组成的mPC-1基因与mD52高度同源,其中,第一外显子代表该基因的特异性序列,实验证据显示mPC-1基因具有自己的启动子,推测mPC-1与小鼠mD52可能是重叠基因.对小鼠20种组织器官和不同发育阶段的胚胎组织cDNA的RT-PCR检测证实,该基因主要在前列腺、肾和眼组织中表达,在胃和平滑肌中有少量表达,在其他组织中表达很弱或不表达.而mD52基因则几乎广泛存在于小鼠的各个组织器官中,因此,两个基因虽然序列上高度重叠却是独立调控的.综上所述,mPC-1基因可能是一个与人PC-1基因结构功能类似的新基因.     

ITS序列结合培养特征鉴定梨树腐烂病菌

对采自中国4个省份的9个梨树腐烂病菌分离株和7个苹果树腐烂病菌分离株的ITS序列进行了测定和分析,并结合GenBank的有性型Valsa ceratosperma、V. ambiens和V. mali的ITS序列构建了系统发育树。结果表明梨和苹果树的各分离株在ITS核苷酸序列上分化较小（p-distance=1.55%）,均在V. ceratosperma聚类组,但二者又分别处于两个独立小分支。其与V. ambiens和V. mali处在不同的聚类组中,且亲缘关系较远,表明供试梨树腐烂病菌并非V. ambiens。培养性状和生物学特点的研究结果还发现,梨树腐烂病菌各分离株无论在菌落颜色、产孢特点、还是37℃高温的生长情况都和苹果腐烂病菌有一定差别。前者菌落始在PDA终为乳白色,而后者菌落初为白色后期变褐色;在20% ABA上,前者形成的产孢体较大而数量较少,在37℃高温下能正常生长,后者则形成的产孢体较小而数量较多,在37℃高温下不能正常生长。并未发现二者在子实体上有稳定明显的差异。因而表明梨树腐烂病菌应为V. ceratosperma,但可用培养性状和生物学特点进行区分其和苹果树腐烂病菌。     

5-Aza-CdR对胶质瘤细胞生长及LRRC4基因异常甲基化的影响

LRRC4是一个新发现的胶质瘤抑瘤基因,它在多种胶质瘤细胞系和胶质瘤组织表达缺失或下调,前期研究结果表明胶质瘤细胞和组织中LRRC4的编码区未发生突变、缺失或重排．为了获得LRRC4作为胶质瘤抑瘤基因的进一步证据,采用去甲基化制剂5-Aza-CdR处理LRRC4表达缺失的SF126和SF767胶质瘤细胞,MSP和RT-PCR检测表明,LRRC4的启动子在表达缺失的SF126和SF767细胞存在完全的甲基化,而5-Aza-CdR能逆转LRRC4启动子的甲基化状态,恢复LRRC4的表达．MTT法测定显示,5-Aza-CdR使SF126和SF767胶质瘤细胞增殖受到明显抑制,并呈时间和剂量的依赖性．同时流式细胞仪检测显示,5-Aza-CdR使SF126和SF767胶质瘤细胞周期阻滞于G0/G1期．因此,5-Aza-CdR能抑制胶质瘤细胞SF126和SF767增殖并干扰其细胞周期,LRRC4启动子异常甲基化是其在胶质瘤细胞中表达缺失的重要机制,5-Aza-CdR能逆转LRRC4基因的甲基化,恢复LRRC4的表达,为LRRC4作为胶质瘤去甲基化治疗的靶标提供了科学依据．     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚．为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58)．其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性．最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1 (由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体) 分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达．研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要．     

hpc2研究进展

生物个体的胚胎发育以及细胞的增殖、分化,都同时受到多种基因的严格调控,PcG基因家族就是一类重要的发育相关基因.而hPc2基因是人PcG基因家族中的一个重要成员,其编码的HPC2蛋白,不仅可以和HPH、BMI-1以及RING1等其他人类PcG蛋白结合形成HPC/HPH PcG复合体,以蛋白复合体的形式参与对homeotic基因的表达抑制,以维持机体的正常发育以及细胞的增殖和定向分化,还发现它能与其他多种蛋白质相结合,提示HPC2可能具有多种功能.因此,对hPc2的深入研究不仅有助于进一步阐明PcG基因家族的作用机理,扩展人们对基因表达调控的认识,还有助于发现PcG基因家族与其他信号转导通路的联系,更好地理解细胞信号网络系统.     

小菜蛾幼虫偏好表达的microRNA鉴定及功能研究

[目的]microRNA(miRNA)在昆虫生长发育中发挥重要功能,本研究拟通过鉴定小菜蛾不同发育阶段的miRNA,挖掘幼虫偏好表达的miRNA及其潜在功能.[方法]对小菜蛾卵、3龄幼虫、蛹和成虫的miRNA开展高通量测序,结合生物信息学分析方法,筛选在幼虫期偏好表达的miRNA;借助实时荧光定量PCR技术,验证候选m...     

携带与非携带松材线虫的松墨天牛miRNA表达谱比较分析

【目的】松墨天牛是松树的重要蛀干害虫,也是林业重大外来入侵种松材线虫的媒介昆虫。虽然松墨天牛和松材线虫互作的化学生态和分子进化机制受到人们的广泛关注,但miRNA等表观遗传因子在天牛—线虫互作中的作用未见报道。【方法】使用illumina HiSeq 2000平台进行miRNA高通量测序,得到4个携带线虫的天牛miRNA库和4个未携带线虫的天牛miRNA库。此外,对鉴定出的miRNA进行了差异表达分析,并对这些miRNA的靶基因进行了GO注释和KEGG通路富集分析。【结果】在携带线虫的天牛表皮、脂肪体、中肠和气管样本中分别鉴定出780、802、617和762个miRNA;在未携带松材线虫的天牛的不同组织样本中分别鉴定出784、723、713和837个miRNA。在携带松材线虫的松墨天牛中,某些已知miRNA表达量会显著升高,如miR-14、miR279和miR-312等。差异表达miRNA的功能大多指向代谢、免疫等方面。【结论】miRNA在松墨天牛和松材线虫互作中起着重要的调控作用。     

综述: 衰老相关microRNAs研究进展

microRNAs(miRNAs)是一类长度约22个核苷酸的非编码RNA.这是一种广泛存在于真核生物中的内源性单链小分子RNA,miRNAs通过部分碱基对互补方式与靶基因结合,在转录和转录后水平调节靶基因表达.最近研究发现,miRNAs可以靶向多个衰老相关信号通路,在线虫、果蝇、小鼠和人类的衰老过程中发挥了重要的调控作用.本文总结了近年来与衰老相关的miRNAs的研究进展,首先介绍衰老相关的信号通路,然后重点介绍与线虫和哺乳动物衰老有关的miRNAs,以及这些miRNAs如何调控衰老相关信号通路,从而影响细胞、组织和整个机体的衰老进程和衰老相关性疾病,最后展望该领域未来的研究方向.     

Molecular cloning and characterization of the dpy-20 gene of Caenorhabditis elegans

We describe the molecular analysis of the dpy20 gene in Caenorhabditis elegans. Isolation of genomic sequences was facilitated by the availability of a mutation that resulted from insertion of a Tc1 transposable element into the dpy-20 gene. The Tc1 insertion site in the m474:: Tc1 allele was identified and was found to lie within the coding region of dpy-20. Three revertants (two wild-type and one partial revertant) resulted from the excision of this Tc1 element. Genomic dpy-20 clones were isolated from a library of wild-type DNA and were found to lie just to the left of the unc-22 locus on the physical map, compatible with the position of dpy-20 on the genetic map. Cosmid DNA containing the dpy-20 gene was successfully used to rescue the mutant phenotype of animals homozygous for another dpy-20 allele, e1282ts. Sequence analysis of the putative dpy-20 homologue in Caenorhabditis briggsae was performed to confirm identification of the coding regions of the C. elegans gene and to identify conserved regulatory regions. Sequence analysis of dpy-20 revealed that it was not similar to other genes encoding known cuticle components such as collagen or cuticulin. The dpy-20 gene product, therefore, identifies a previously unknown type of protein that may be directly or indirectly involved in cuticle function. Northern blot analysis showed that dpy-20 is expressed predominantly in the second larval stage and that the mRNA is not at all abundant. Data from temperature shift studies using the temperature-sensitive allele e1282ts showed that the sensitive period also occurs at approximately the second larval stage. Therefore, expression of dpy-20 mRNA and function of the DPY-20 protein are closely linked temporally.     

miRNA响应印度梨形孢定殖调控大麦生长发育的作用机制

【背景】内生真菌印度梨形孢(Piriformospora indica)定殖植物可以显著促进植物生长发育。miRNA已被证实在植物体的生长发育中具有调控作用。【目的】揭示印度梨形孢定殖大麦促进大麦生长发育过程中miRNA对印度梨形孢定殖的响应及对大麦生长发育的调控作用。【方法】提取大麦总RNA,实施转录组测序并进行序列比对与数据挖掘;使用高效液相色谱检测大麦生长素等激素水平变化。【结果】印度梨形孢对大麦有显著促生作用;全转录组测序结果显示：印度梨形孢侵染3 d较空白对照有18个差异表达的miRNA,其中11个miRNA上调、7个miRNA下调;侵染7 d与空白对照相比24个差异表达的miRNA,其中11个miRNA上调、13个miRNA下调;侵染3 d与侵染7 d相比有3个miRNA上调、6个miRNA下调。GO功能富集分析与KEGG通路分析显示,差异表达miRNA的靶基因主要参与转录、细胞分裂、生长素信号的感知和转导、光合作用和激素刺激响应。靶基因所参与的途径与大麦生长发育密切相关,暗示miRNA对印度梨形孢定殖过程做出了积极响应。代谢产物分析表明miRNA参与的调控路径的代谢产物发生改变。【结论】本研究以miRNA为入手点,探究了miRNA对大麦生长发育的调控机制,为揭示印度梨形孢的促生机制提供了新的研究方向。     

Characterization of thelet-653 gene inCaenorhabditis elegans

A mutation in thelet-653 gene ofCaenorhabditis elegans results in larval death. The lethal arrest is concurrent with the appearance of a vacuole anterior to the lower pharyngeal bulb. The position of the vacuole is consistent with a dysfunction of the secretory/excretory apparatus. Germline transformation rescue experiments were able to position thelet-653 gene to two overlapping cosmid subclones. Sequence data generated from both cDNA and genomic DNA subclones indicated thatlet-653 encodes a mucin-like protein. Our characterization suggests that a mucin-like protein is essential for effective functioning of the secretory/excretory apparatus withinC. elegans.     

模拟微重力下秀丽隐杆线虫的力学感知和肌萎缩的发生机制——太空飞行线虫试验地面平行对照研究部分

目前,微重力导致肌萎缩的分子机制尚不清楚,重力感知是该事件发生的关键环节．为了回答这一问题,在此之前首先实施了太空线虫试验,这部分结果已经在本刊报道过．而本次研究主要是在地面上建立了模拟微重力环境,观察处理后秀丽隐杆线虫（C.elegans）体壁肌细胞结构和功能的变化,一方面用于验证太空试验,同时比较两种处理结果的异同,以便于评价地面模拟微重力的有效性．经过14天19．5h旋转模拟微重力处理后,对线虫生存率和运动能力进行了观察,并检测了几个重要的肌相关基因表达和蛋白质水平．模拟微重力下线虫生存率没有明显变化,但运动频率显著下降,爬行轨迹也发生了轻微改变,运动幅度降低,提示线虫运动功能出现障碍．从形态学上观察发现：肌球蛋白A（myosin A）免疫荧光染色显示模拟微重力组肌纤维面积缩小,而肌细胞致密体（dense-body）染色可见荧光亮度下降．这些结果直接提示模拟微重力使线虫出现了肌萎缩．随后Western blotting试验结果揭示,模拟微重力组线虫体壁肌的主要结构蛋白——myosin A含量减少,进一步确证了微重力性肌萎缩发生．在基因水平,旋转后抗肌萎缩蛋白基因（dys-1）表达明显上升,而hlh-1,unc-54,myo-3和egl-19的mRNA水平均下调,提示dys-1在骨骼肌感知和传导力学信息方面有重要作用,而hlh-1,unc-54,myo-3和egl-19则分别从结构和功能两个途径促进了微重力性肌萎缩的发生和发展．本次试验所得到的结果同太空飞行试验结果十分相似,一方面强化了太空试验结论,另一方面说明在地面上模拟微重力对生物体进行研究是有效可行的,将有助于提高太空试验的质量．     

The influences of PRG-1 on the expression of small RNAs and mRNAs

Background

In metazoans, Piwi-related Argonaute proteins play important roles in maintaining germline integrity and fertility and have been linked to a class of germline-enriched small RNAs termed piRNAs. Caenorhabditis elegans encodes two Piwi family proteins called PRG-1 and PRG-2, and PRG-1 interacts with the C. elegans piRNAs (21U-RNAs). Previous studies found that mutation of prg-1 causes a marked reduction in the expression of 21U-RNAs, temperature-sensitive defects in fertility and other phenotypic defects.

Results

In this study, we wanted to systematically demonstrate the function of PRG-1 in the regulation of small RNAs and their targets. By analyzing small RNAs and mRNAs with and without a mutation in prg-1 during C. elegans development, we demonstrated that (1) mutation of prg-1 leads to a decrease in the expression of 21U-RNAs, and causes 35 ~ 40% of miRNAs to be down-regulated; (2) in C. elegans, approximately 3% (6% in L4) of protein-coding genes are differentially expressed after mutating prg-1, and 60 ~ 70% of these substantially altered protein-coding genes are up-regulated; (3) the target genes of the down-regulated miRNAs and the candidate target genes of the down-regulated 21U-RNAs are enriched in the up-regulated protein-coding genes; and (4) PRG-1 regulates protein-coding genes by down-regulating small RNAs (miRNAs and 21U-RNAs) that target genes that participate in the development of C. elegans.

Conclusions

In prg-1-mutated C. elegans, the expression of miRNAs and 21U-RNAs was reduced, and the protein-coding targets, which were associated with the development of C. elegans, were up-regulated. This may be the mechanism underlying PRG-1 function.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/1471-2164-15-321) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

microRNAs与TP53基因调控网络研究进展

TP53基因(编码p53蛋白)作为一个重要的抑瘤基因,通过调控一系列信号转导通路广泛参与了多种恶性肿瘤的发生发展,一直是肿瘤分子生物学研究领域的热点.最近的研究发现,microRNAs(miRNAs)参与了TP53的信号通路,它们之间存在着复杂的调控网络.一方面,p53通过调控一些miRNAs的转录及转录后成熟,促进细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和衰老,抑制肿瘤发生.另一方面,许多miRNAs,如miR-25、miR-30d、miR-125b和miR-504等可直接调控p53的表达与活性,参与TP53信号通路的调节,还有一些miRNAs则通过调节p53上下游基因,发挥重要的生物学功能.其中,最具有代表性的是miR-34家族,它们受p53直接调控并参与TP53信号通路,通过靶向抑制多个TP53信号通路关键分子的表达,发挥抑瘤作用.此外,它们还可以通过抑制沉默信息调节子,增强p53的活性,反馈调节TP53信号通路.miRNAs与TP53之间调控网络的研究,是对TP53抑瘤机制的重要补充.     

纤枝短月藓BeLEA2基因的克隆及表达分析

为探究纤枝短月藓LEA2基因的结构和表达特征,该研究以纤枝短月藓为材料,首次利用PCR克隆技术得到纤枝短月藓BeLEA2基因序列,并对该基因进行分析。结果表明:(1)该基因序列中含有2个外显子和1个内含子,其开放阅读框(ORF)为456 bp,编码151个氨基酸,预测其相对分子质量为16515.96 Da。(2)将纤枝短月藓与其他植物LEA2基因氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示纤枝短月藓与小立碗藓的亲缘关系最近。(3)利用HiTail-PCR技术克隆获得1072 bp的BeLEA2启动子序列,用PlantCARE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行预测,结果表明该启动子除了含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他顺式元件。(4)实时荧光定量PCR分析表明,BeLEA2基因在纤枝短月藓不同发育时期和不同组织中都有表达,且对脱水胁迫有响应。以上结果为进一步探究LEA2基因在苔藓植物中的功能及作用机制奠定了基础。