乙醇干扰斑马鱼胚胎发育中底索和背主动脉的形成

人类胚胎期乙醇暴露对心血管系统有严重致畸作用. 用不同浓度的乙醇处理斑马鱼胚胎, 发现能够干扰其胚胎循环系统的建立, 半数有效浓度(EC50)为182.5 mmol/L. 乙醇短暂暴露实验显示圆顶期为敏感时间窗, 400 mmol/L乙醇短暂暴露3 h能够导致43%的胚胎产生循环障碍. 我们排除了乙醇对斑马鱼造血系统影响, 通过血管内皮细胞分子标记(Flk-1)进行原位杂交显示, 乙醇干扰了躯干部体轴血管的建立, 而对头面部血管没有影响. 用动脉和静脉的分子标记(ephrinB2和ephB4)进行原位杂交以及半薄切片显示, 乙醇主要干扰斑马鱼背主动脉的形成, 而对体轴静脉没有明显影响. 进一步研究表明, 乙醇影响斑马鱼底索的发育, 因缺少底索分泌的Radar和Ang-1等血管形成因子, 间接地影响了背主动脉的形成和稳定. 这些结果为研究乙醇对人类心血管系统发育的影响提供了线索.     

叶酸缺乏对斑马鱼背主动脉发育的影响

目的观察叶酸缺乏斑马鱼胚胎的背主动脉（DA）发育情况,初步探讨叶酸缺乏后胚胎DA发育异常的机理。方法采用将二氢叶酸还原酶（DHFR）功能阻断的方法构建叶酸缺乏斑马鱼模型,分别应用DHFR抑制剂甲氨蝶呤（MTX）以及DHFR基因knock-down技术处理斑马鱼胚胎。在胚胎发育至48 hpf时在显微镜下观察胚胎的整体发育情况,在60 hpf时应用荧光显微造影的方法观察胚胎的背主动脉发育状况。利用胚胎整体原位杂交和real-time PCR的方法检测影响DA发育的关键因子ephrinB2、Ang-1和Radar的表达情况,利用TUNEL法检测胚胎底索的凋亡情况。结果MTX处理组胚胎以及DHFR knock-down组胚胎有相似的胚胎发育异常表型。荧光显微造影显示叶酸缺乏组胚胎的DA发育异常。叶酸缺乏组胚胎的ephrinB2、Ang-1和Radar表达减弱,底索凋亡增加。结论叶酸缺乏可导致斑马鱼胚胎背主动脉发育异常,其机理与ephrinB2、Ang-1和Radar的表达减弱以及底索凋亡增加有关。     

卵黄蛋白原1(vtg1)启动子调控绿色荧光蛋白表达的转基因斑马鱼的构建

环境雌激素严重危害人类的健康.为了简便直观地检测水环境中的雌激素污染,构建了一种转基因斑马鱼,在这种鱼的体内,利用卵黄蛋白原1(vitellogenin1,vtg1)的启动子调控报告基因绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)的表达.用1ng/L的17!-炔雌醇(17"-ethynylestradiol,EE2)诱导4天后,仔鱼肝脏中出现绿色荧光.RT-PCR和整体原位杂交实验证实,仔鱼体内EGFP和vtg1的时空表达模式相同.通过在显微镜下观察转基因鱼的绿色荧光,可以直观判断水环境中是否含有雌激素活性物质.该研究为环境雌激素的监测提供了一种简便直观的新型工具.     

二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用

目的观察二氢叶酸还原酶基因(DHFR)功能阻抑斑马鱼胚胎的颅脑部发育情况,初步探讨二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用。方法采用显微注射吗啡啉修饰的反义核苷酸(MO)的方法进行DHFR表达阻抑。胚胎发育至受精后48hpf观察胚胎的颅部发育情况,在60hpf时经石蜡切片进一步观察胚胎的脑发育状况。利用胚胎整体原位杂交的方法检测影响神经系统发育的关键因子ngn1和huc的表达情况。结果显微注射MO可成功的进行DHFR表达阻抑。DHFR表达阻抑组胚胎存在颅脑部发育明显异常和ngn1、huc的表达强度明显减弱,且与显微注射的MO剂量呈正相关。结论DHFR在斑马鱼颅脑发育中有重要作用;其功能阻抑可导致胚胎颅脑部发育异常,其机理与ngn1和huc的的表达减弱有关。     

原钙黏附蛋白18b基因抑制对斑马鱼神经系统发育的影响

原钙黏附蛋白18b(Protocadherin18b,Pcdh18b)属于钙黏附蛋白家族成员．为了研究pcdh18b基因抑制对斑马鱼神经系统发育的影响,针对pcdh18b的翻译起始位点设计一个吗啡啉修饰的反义寡核苷酸抑制其表达,在斑马鱼受精卵一到二细胞期注射并且验证其有效性．注射后用原位杂交和吖啶橙染色检测神经系统的表型和标志基因的表达．pcdh18b下调使神经前体细胞的标志基因neurog1、神经元标志基因elavl3和神经胶质细胞标志基因gfap的表达均出现下调,中后脑边界的标志基因pax2a和wnt1表达减弱并出现神经管分叉现象,同时与后脑分节相关的基因krox20表达减少．吖啶橙染色显示pcdh18b下调后斑马鱼中脑、后脑及中后脑边界细胞凋亡增多．这些结果表明pcdh18b抑制导致了斑马鱼神经系统发育的异常．     

二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼咽弓发育过程中作用的研究

叶酸缺乏可导致胚胎先天性发育异常,二氢叶酸还原酶是叶酸生物学作用通路中的关键因子,其功能阻抑将抑制叶酸生物学作用的发挥.咽弓是脊椎动物胚胎发育中头面部结构、心脏流出道等的共同前体.在模式生物斑马鱼中,利用基因表达阻抑以及过表达技术,探讨二氢叶酸还原酶基因(DHFR)在斑马鱼咽弓发育过程中的作用.石蜡切片以及软骨染色结果显示,DHFR表达阻抑导致斑马鱼咽弓以及腭发育明显异常,而DHFR过表达可部分挽救上述发育异常表型.TBX1和HAND2在咽弓发育中有重要作用.通过胚胎整体原位杂交以及Real-timePCR技术检测TBX1和HAND2表达水平.DHFR表达阻抑后TBX1和HAND2的表达降低,DHFR过表达可使TBX1和HAND2的表达增加.上述结果表明,DHFR在斑马鱼咽弓发育过程中扮演重要角色,DHFR通过影响TBX1和HAND2的表达而调控咽弓的形成和分化.     

BHC80基因抑制对斑马鱼胚胎红细胞发育的影响

胚胎整体RNA原位杂交显示,BHC80基因表达主要集中在中枢神经系统部位． 应用吗啡啉修饰的反义寡核苷酸技术抑制BHC80基因表达,显示胚胎红细胞减少并堆积在PBI区,用胚胎期红细胞标志βe3 globin以及造血过程中的重要转录因子gata1、c-myb、lmo2的胚胎整体RNA原位杂交实验显示,BHC80基因表达下调使gata1标记胚胎红系前体细胞增殖增多并且分化延迟,导致红细胞减少和PBI区红细胞堆积． 血管内皮标志基因flk-1的RNA探针原位杂交和荧光显微造影显示,BHC80基因表达下调组血管与对照组相比清晰可见无明显差异．     

Tbx1基因功能下调影响斑马鱼Tbx20和Tbx2表达

目的采用吗啡啉修饰反义寡核苷酸显微注射方法下调斑马鱼Tbx1基因表达,研究斑马鱼Tbx1基因功能下调对其他两个T盒基因Tbx20和Tbx2表达的影响。方法采用吗啡啉修饰的反义寡核苷酸显微注射方法抑制斑马鱼Tbx1基因表达,分别将2.5、5、8、10 ng吗啡啉反义寡核苷酸在斑马鱼0-4细胞期注入胚胎,并构建Tbx20,骨形成蛋白2b（Bmp2b）和Tbx2反义RNA探针,进行整体原位杂交,观察Tbx1基因下调对Tbx20、Bmp2b及Tbx2表达的影响。结果Tbx1吗啡啉寡核苷酸显微注射组胚胎表现出鳃弓、耳囊、心血管系统和胸腺的发育异常。Tbx1基因下调导致Tbx20的表达出现改变,Tbx20在心脏的表达与对照组相比明显下调,神经元的表达范围明显缩小;Tbx1基因功能下调会导致Bmp2b在心脏和咽囊的表达减低,Bmp2b在后部咽囊的表达较前部咽囊减低得更为明显;Tbx1基因功能下调胚胎,Tbx2在鳃弓的表达模式发生改变,48 hpf,Tbx2在鳃弓的表达出现从后向前逐渐减低,鳃弓的表达范围较对照组明显缩小。结论Tbx1在发育过程中,会对其他T盒基因,如Tbx20和Tbx2具有激活或抑制的调控作用。Tbx1对Tbx20的作用可能是通过影响Bmp2b的途径,继发地影响Tbx20的表达。Tbx1基因功能下调,会改变Tbx2在鳃弓的表达模式。