来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。     

嗜热网球菌纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

通过化学方法合成嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)来源的纤维二糖差向异构酶基因ce,将其引入到载体pBSuL3-ce,构建重组质粒pBSuL3-ce并转化进枯草芽孢杆菌,发酵48h后测定胞内酶活为7. 5U/ml。酶学性质结果表明:该酶的最适pH为8. 5;最适温度为85℃,85℃的半衰期为120min。为降低发酵成本,对发酵培养基进行优化:以35g/L豆粕粉为氮源、5g/L甘油为碳源时,酶活力最高可达12. 3U/ml。依据摇瓶优化的条件在3L发酵罐中扩大培养,胞内酶活达到56U/ml,比摇瓶培养酶活提高了8倍。利用发酵所得酶制备乳果糖,在乳糖浓度为400g/L、反应温度为85℃、初始pH 8. 5、加酶量为20U/ml的条件下,乳果糖转化率可达51%。     

黑曲霉发酵产橙皮苷酶的工艺优化

目的:对黑曲霉WP124发酵产橙皮苷酶的工艺条件进行优化,旨在为利用酶法改造橙皮苷打下基础.方法:采用摇瓶培养,对培养基的成分和培养条件进行了优化.结果:黑曲霉WP124发酵产橙皮苷酶的最佳培养基组成是:蔗糖30g/L,酵母膏20g/L,磷酸二氢钾3g/L,桔皮粉50g/L;最佳培养条件是:起始pH为5.5,培养温度为30℃,摇瓶转速是180r/min.在上述条件下,经过72h的培养,橙皮苷酶酶活达到1398U/mL.结论:该菌株发酵过程具有较好的工业化应用的前景.     

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp.strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化.研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成,结果为:蛋白胨60 g/L,麦芽糖30 g/L,MgSO4 0.5 g/L,ZnSO4 0.01 g/L,KCl 1.0 g/L.优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL).摇瓶培养最佳条件为:装液量40%,发酵pH 6.5,接种量10%,发酵温度30℃.考察了细胞生长及产酶的时间进程,最佳培养时间为25 h.     

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp. strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化。研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响, 应用正交试验优化发酵培养基组成, 结果为: 蛋白胨 60 g/L, 麦芽糖 30 g/L, MgSO4 0.5 g/L, ZnSO4 0.01 g/L, KCl 1.0 g/L。优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL)。摇瓶培养最佳条件为: 装液量40 %, 发酵pH 6.5, 接种量10 %, 发酵温度30 ℃。考察了细胞生长及产酶的时间进程, 最佳培养时间为25 h。     

一株产几丁质酶菌株的筛选及其产酶条件的研究

采用平板透明圈法从土壤中分离筛选到一株产几丁质酶放线菌株L12,用250mL摇瓶发酵初筛和复筛,酶活力为0.63U/mL。通过产酶条件实验,初步确定了该菌株较适产酶培养基和摇瓶发酵条件。条件优化后,30℃、250mL摇瓶发酵48h,几丁质酶活力达到1.06U/mL。     

重组枯草芽孢杆菌发酵廉价原料生产普鲁兰酶

[目的]构建长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体枯草芽孢杆菌工程菌株,优化发酵条件,筛选廉价的培养基原料生产普鲁兰酶。[方法]利用分子生物学手段,将基因pul324和表达载体p WB980连接,构建表达质粒p WB-pul324并转化Bacillus subtilis WB600;对表达产物进行SDS-PAGE分析和初始酶活的测定。进一步优化发酵条件,对不同碳源和氮源进行发酵培养基的筛选,同时研究不同金属离子的添加和培养基初始p H、接种量对发酵产酶的影响。[结果]获得基因工程菌B.subtilis WB600/p WB-pul324,SDS-PAGE电泳结果显示在89 k Da处有特异性条带,发酵初始酶活为12.34 U/ml;筛选得到玉米淀粉水解液和玉米浆干粉为培养基最适碳源和氮源,其最适浓度分别为50 g/L和30 g/L。Mn~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)和Tween-80的添加能提高发酵产酶活力。在最适初始p H 6.5,以最适5%接种量接种于优化后的培养基中,摇瓶发酵80 h普鲁兰酶的酶活达到414.48 U/ml。[结论]实现了普鲁兰酶突变体在枯草芽孢杆菌中的高效表达,筛选获得的培养基主要原料经济低廉,经过发酵条件优化后,重组菌酶活达到414.48 U/ml,是之前研究结果(20.16U/ml)的20倍。     

褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化

对一株从腐烂海带中筛选得到的产褐藻胶裂解酶的菌株进行鉴定,并对其产酶条件进行发酵优化。经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定,将其鉴定为盐单胞菌属,并命名为Halomonas sp. WF6。通过在摇瓶培养水平上进行单因素和多因素正交试验,确定褐藻胶裂解酶产生菌WF6的最适产酶培养基为：褐藻酸钠6.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,酵母粉2.5 g/L,NaCl 30 g/L,K⁺ 5 mmol/L。进而采用最适培养基进行产酶条件的优化,优化后的发酵产酶条件为：初始pH 8.0,培养温度25℃,接种量为2%,摇瓶装液量30 ml/250 ml,培养时间39 h。优化后的褐藻胶裂解酶酶活达117.66 U/ml,是优化前的2.1倍。该酶对褐藻酸钠的酶解产物主要由聚合度为二和三的褐藻寡糖组成。     

重组大肠杆菌产Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化

为了实现来源于Streptomyces sp. FA1的木聚糖酶的高效胞外分泌表达,对E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)/coe/xynA基因工程菌的发酵产酶诱导条件进行优化,获得最优的诱导条件为25 ℃发酵6 h后添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。在此基础上对发酵培养基进一步优化,得到最优培养基成分为:甘油11 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨8 g/L,磷酸盐浓度89 mmol/L,镁离子4 mmol/L。最终酶活达到780.2 U/ml,为未优化前的2.2倍,是目前大肠杆菌摇瓶发酵产木聚糖酶的最高表达水平,为实现该酶的工业化生产奠定基础。     

嗜热棉毛菌木糖苷酶Xyl43基因优化及其在毕赤酵母中高效表达

【目的】通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现木糖苷酶的高效表达。【方法】基于毕赤酵母密码子偏好性优化嗜热棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密码子,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达,并对重组木糖苷酶酶学性质进行分析。通过单因素实验优化高产菌株的摇瓶发酵条件,并在5 L发酵罐中进行扩大培养。【结果】Xyl43基因优化后的序列中222个碱基发生改变,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性为78.17%;将构建的表达载体p PIC9K-Opt Xyl43电击转入毕赤酵母中,利用平板初筛和摇瓶复筛获得一株高效表达重组菌(命名为P.pastoris GS115-Xyl43);其所产重组木糖苷酶大小为51.5 k D,动力学参数Km为2.93 mmol/L、Vmax为157.9μmol/(min·mg),最适反应温度55°C,最适p H 7.0,在p H 6.0-9.5条件下具有良好的稳定性;摇瓶优化结果表明:培养基初始p H 6.0、甲醇补加浓度1.0%、培养温度28°C、摇床转速250 r/min为最佳产酶条件,在此条件下发酵144 h胞外酶活达到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L发酵罐放大培养,发酵156 h(甲醇诱导96 h),木糖苷酶酶活为222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,较摇瓶提高了4.3倍。【结论】木糖苷酶在毕赤酵母中实现了高效表达,具有较好的工业化应用前景。     

产脂肪酶重组枯草芽胞杆菌的发酵优化

笔者所在实验室前期筛选到1株产脂肪酶粘质沙雷氏菌,克隆其脂肪酶基因,构建重组枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-lipA,成功实现了来源于粘质沙雷氏菌的脂肪酶基因在枯草芽胞杆菌中的表达。基于以上工作基础上,对B.subtilis 168/pMA5-lipA进行了摇瓶水平上的产酶发酵优化。首先通过单因素和正交试验确定了有利于产脂肪酶的最佳培养基成分,并对发酵条件进行了优化。结果表明:优化后的培养基组分为蔗糖35 g/L,玉米浆27.5 g/L,(NH4)2SO41.25 g/L,CaCl24 g/L,pH 7.0。在最优发酵培养基的条件下,37℃、160 r/min摇床培养33 h,每毫升发酵液中重组菌脂肪酶酶活可达98.6 U,是优化前的3倍。     

Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶在Bacillus subtilis中的重组表达和发酵优化

为实现Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)基因tre Y在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的重组表达,以质粒p ET-24a(+)-tre Y为模板PCR扩增得到目的基因,并与表达载体pHY300PLK连接,转入表达宿主Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中,重组菌在TB培养基中培养48 h后MTSase酶活达到17.5 U/m L;在此基础上对重组菌发酵条件进行优化,通过单因素实验(氮源种类、氮源复配、氮源浓度、碳源种类、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)和正交实验(氮源浓度、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)确定其摇瓶发酵产酶的最适培养基和培养条件为:氮源(工业蛋白胨∶棉籽粉=3∶1)48.0 g/L、葡萄糖为10.0 g/L、培养基初始pH为7.0,最适培养温度为30℃;在此条件下,MTSase的酶活可达41.5 U/m L,是优化前的2.4倍。     

重组大肠杆菌高效分泌表达β-木糖苷酶发酵条件的优化

[目的]嗜热拟青霉β-木糖苷酶基因在大肠杆菌中高效分泌表述重组β-木糖哥酶摇瓶发酵条件优化,及5 L发酵罐放大培养.[方法]通过单因素试验对诱导剂种类及其添加量、诱导起始 OD600、培养温度、培养时间进行优化研究.[结果]摇瓶优化结果表明:2％乳糖为诱导剂、培养温度为33℃C、OD600控制在0.8-0.9时诱导为最佳产酶条件,在此条件下培养48 h后胞外酶活达到103.9 U/mL,胞外分泌的比例高达99％以上.进行5L发酵罐放大培养,发酵48 h胞外酶活达到最高值392.5 U/mL,蛋白含量为10.1 g/L.[结论]该重组大肠杆菌高效分泌β-木糖苷酶,具有较好的工业化生产前景.     

高山被孢霉产花生四烯酸发酵条件的研究

通过一株高山被孢霉M_(20)(Mortierella alpina)产花生四烯酸的摇瓶发酵研究,确定了其最佳发酵培养基组成及最适摇瓶发酵工艺条件。摇瓶实验确定的最佳培养基组成为(g/L):玉米粉水解液葡萄糖150,酵母粉15,KH_2PO_4 3.0,NaNO_3 3.0,MgSO_4·7H_2O 0.5。最佳发酵工艺条件为:初始pH6.5,装液量为50ml/500ml摇瓶,摇床转速150r/min,温度在菌体生长前三天控制在25℃培养,以后调至20℃培养。在此条件下,发酵培养被孢霉的生物量、菌体总油脂及花生四烯酸分别高达35.5g/L、13.2g/L及2.2g/L,在15L及1000L自动机械搅拌罐进行发酵试验,AA产量分别高达1.86g/L及1.70g/L。     

α-氯丙酸脱卤酶发酵条件研究

以从厌氧污泥中分离筛选获得的对α-氯丙酸有高效脱卤能力的微生物菌株W20为出发菌株,对其发酵生产脱卤酶的工艺进行了研究。其产脱卤酶培养基组成为:葡萄糖20.0 g/L,尿素1.0 g/L,酵母膏0.5 g/L,Na2HPO4.12H2O 3.2 g/L,KH2PO41.5 g/L,无水MgSO40.098 g/L,微量元素液10 mL/L,维生素溶液5.0 mL/L。产酶条件为:接种量10%,培养基初始pH7.0,培养温度30℃,装液量80 mL/250 mL摇瓶,摇床转速180 r/min。在以上获得的培养基和培养条件下培养48 h后测酶活,脱卤酶活力达到8.76 U/g干菌体,比在原始条件下提高约10倍。     

复合与合成培养基对大肠杆菌胞外生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的影响

为实现来源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT酶）的高效胞外表达,以含分泌型信号肽OmpA的大肠杆菌E.coli BL21（DE3）{pET-20b（+）/α-cgt}为研究对象,比较了其在不同诱导条件下复合与合成培养基中生长产酶的规律。结果表明在添加甘氨酸的条件下采用合成培养基,以0.8 g/L/h的乳糖进行流加诱导所得的胞外酶活和生产强度最高。在该条件下发酵30小时后胞外α-CGT酶的环化活性达113.0U/ml（水解活性为79 100.0IU/ml）,是复合培养基胞外产酶的2.3倍,完全满足工业化生产的需求。     

基因工程菌Pichia pastoris高密度培养条件研究

基因工程菌pichiapastoris最佳种子培养基为添加4mL/LPTMl的BMGY培养基;全合成高密度摇瓶培养基是甘油4%,(NH4)2SO410g/L,CaSO40.93g/L,K2SO418.2g/L,MgSO4@7H2O14.9g/L,0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=6.0)配制,培养26h后细胞密度OD600可达到65。经SDS-PAGE电泳图谱分析,甲醇诱导培养72h结果12h有重组人血清白蛋白表达,24h达到最大。此全合成摇瓶培养基与批补料发酵培养基相类似,有利于指导发酵罐上发酵培养。     

产青霉素酶枯草芽孢杆菌发酵条件的优化

目的:对一株产青霉素酶的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis DB104/pWB-pemp)的摇瓶发酵条件进行优化.方法:利用单因素实验及正交实验等方法考查重组菌摇瓶发酵条件,研究不同浓度的碳源、氮源、金属离子、磷酸盐及不同pH、接种量、装液量和温度等条件对产青霉素酶的影响.结果:重组菌株摇瓶最适发酵条件为pH 7.0、接种量3％、装液量14％、发酵温度37℃,培养基成分为2％蔗糖、3.5％酵母膏、0.1mmol/L镁离子、0.4％磷酸盐.结论:最优条件下,发酵36h,产酶活力达到2227.8U/mL,为先前研究结果(1 580 U/mL)的1.41倍,为重组菌的大规模发酵生产奠定了基础.     

MntH与含锰过氧化氢酶共表达基因工程菌的构建与发酵优化

构建Mn2+转运蛋白MntH与来源于Thermus thermophilus HB27的含锰过氧化氢酶的共表达基因工程菌,并进行了发酵培养基及培养环境条件的优化,确定培养基中最佳的碳氮源种类及其浓度分别为:甘油7.0 g/L,酵母粉3.75 g/L和蛋白胨11.25 g/L;当培养基中的Mn2+浓度为1 mmol/L时,最佳的IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L。此外,最佳的培养基初始p H值及培养温度分别为:p H 8.0和37℃,在最优发酵条件下工程菌摇瓶发酵培养24 h,过氧化氢酶活最高可达476 U/m L是未优化前3倍。在5 L发酵罐的验证实验中,过氧化氢酶的酶活进一步提高至1 094 U/m L。