麦芽糖诱导软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶基因,将基因片段克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103中,转化枯草杆菌WB600得基因工程菌进行外源表达。在1.5%的麦芽糖初始发酵培养基上摇瓶培养,48 h后重组枯草杆菌产酶活性为6.1U/ml。通过单因素分析和响应面分析对重组枯草杆菌产CGT酶摇瓶发酵条件进行优化。分析得到培养基关键组分麦芽糖,玉米淀粉和酵母粉三者最佳浓度分别为:15.5g/L,13g/L和20g/L。在此条件下,摇瓶培养36h后α-CGT酶活性为17.6U/ml,5L罐分批发酵30h后酶活达到20U/ml (水解活性为1.4×10⁴ IU/ml)。     

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）的α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT）基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b（＋）中,构建了表达载体pET-20b（＋）／cgt,并将其转化表达宿主E.coli BL21（DE3）。对重组菌E．coli BL21／pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件：葡萄糖8g/L,乳糖0．5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO472mmol／L,KH2PO417mmol／L,CaCl2 2．5mmol／L;初始pH为7．0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22．1u／mL,与来源菌Pmacerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3L发酵罐中发酵,90h后胞外酶比活达到22．6U／mL,证实了工业化放大的可能性。     

表达酿酒酵母ALAS的重组大肠杆菌胞外5-氨基乙酰丙酸的产量和纯化

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinate,ALA）由5-氨基乙酰丙酸合酶（5-aminolevulinate synthase,ALAS）催化产生。利用重组细菌在大肠杆菌合成ALA已有不少研究。重组真核生物ALAS在大肠杆菌合成ALA的研究没有报道。酿酒酵母ALAS在大肠杆菌重组表达,在摇瓶培养条件下,分析了胞外ALA的产量,重组菌的生长状况和细胞中ALAS的活性,利用两种国产树脂纯化ALA,毛细管电泳分析确定ALA纯度在LB培养基中,初始pH 6.5,含有20mmol/L的酮戊酸、20mmol/L琥珀酸和20mmol/L的甘氨酸,37℃下诱导培养12h,胞外ALA的产量为162mg /L培养基。纯化的ALA纯度达到90%。     

表面活性剂对大肠杆菌胞外生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的影响

研究了不同浓度表面活性剂Tween-80,Triton X-100,SDS对大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT酶）的影响。结果表明：发酵初始添加Tween-80和Triton X-100的最适浓度分别为2％,0.5％,最终胞外酶活分别达2.03U/ml和4.92U/ml,相对于未添加表面活性剂时提高4.6倍和12.67倍,且改变添加时间不能提高酶的产量;发酵36 h添加0.02％SDS对α-CGT酶产量促进最大,最终胞外酶活达5.31U/ml,较对照组提高12.75倍。表面活性剂对α-CGT酶生产的促进作用可能是由大肠杆菌细胞内外膜渗透性增加所致,使细胞周质空间中α-CGT酶能更加快速地渗透到胞外。     

酶法生产L-半胱氨酸产酶培养基的研究

目的:找到能够高效合成L-半胱氨酸合成酶的培养基。方法:研究进行了假单胞菌F12在复合培养基和简单培养基合成L-半胱氨酸能力的对比及产酶过程分析。结果:简单培养基生长的菌体合成L-半胱氨酸能力较高,单位菌体产生L-半胱氨酸能力比复合培养基增大1倍;DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)诱导L-半胱氨酸合成酶的产生;葡萄糖的存在不利于产酶,后期酶的比生产速率为-0.11 U/mg DCW·h,对照中为4.04 U/mg DCW·h。结论:以DL-ATC为碳氮源的基本培养基最有利于产酶。     

来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。     

小麦全蚀病菌胞外β-1,3-葡聚糖酶的产生和部分特性的研究*

本文就小麦全蚀病菌胞外-1,3-葡聚糖酶的产生和部分酶学特性进行了研究。结果表明,小麦全蚀病菌能够产生胞外-1,3-葡聚糖酶。在供试的三种培养基中,最佳产酶培养基为改进的MS培养基。当以改进的MS为基础培养基时,最佳碳源为麦麸皮;最佳氮源为牛肉浸膏;产酶的最适条件为培养基初始pH为6,培养温度为26℃,250ml三角瓶中装培养基量为50ml时接菌量为4块菌饼(直径5mm)。另外,对酶的部分性质的研究结果表明,酶最适作用温度和pH分别为60℃和7.0,在50℃以下以及pH 5.5～7.5范围内稳定。     

小麦全蚀病菌胞外β-1,3-葡聚糖酶的产生和部分特性的研究

本文就小麦全蚀病菌胞外-1,3-葡聚糖酶的产生和部分酶学特性进行了研究。结果表明,小麦全蚀病菌能够产生胞外-1,3-葡聚糖酶。在供试的三种培养基中,最佳产酶培养基为改进的MS培养基。当以改进的MS为基础培养基时,最佳碳源为麦麸皮;最佳氮源为牛肉浸膏;产酶的最适条件为培养基初始pH为6,培养温度为26℃,250ml三角瓶中装培养基量为50ml时接菌量为4块菌饼(直径5mm)。另外,对酶的部分性质的研究结果表明,酶最适作用温度和pH分别为60℃和7.0,在50℃以下以及pH 5.5～7.5范围内稳定。     

小麦全蚀病菌胞外β—1，3—葡聚糖酶的产生和部分特性的研究

本文就小麦全蚀病菌胞外β—1,3-葡聚糖酶的产生和部分酶学特性进行了研究。结果表明,小麦全蚀病菌能够产生胞外β-1,3-葡聚糖酶。在供试的三种培养基中,最佳产酶培养基为改进的MS培养基。当以改进的MS为基础培养基时,最佳碳源为麦麸皮;最佳氮源为牛肉浸膏;产酶的最适条件为培养基初始pH为6,培养温度为26℃,250ml三角瓶中装培养基量为50ml时接菌量为4块菌饼(直径5mm)。另外,对酶的部分性质的研究结果表明,酶最适作用温度和pH分别为60℃和7．0,在50℃以下以及pH=5．5～7．5范围内稳定。     

尖镰孢胞外青霉素V酰化酶的产生

由腐殖土中分离出一株产胞外青霉素Ｖ酰化酶的尖镰孢（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）,编号ＦＰ９４１。研究了该菌在液体培养基中产胞外青霉素Ｖ酰化酶的条件。在以１０％麦麸为碳源的培养基中,添加氮源能促进酶的形成。无机氮源优于有机氮源。（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４的促进效果最佳,草酸铵次之,用量均为１％。为提高产酶量,培养基中添加诱导物是必要的、苯氧乙酸的诱导效果最佳,用量为０．１％,其次是青霉素Ｖ,用量为０．３％。最适培养条件为：培养     

一种酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor的构建及鉴定

以pPIC9为模板,通过PCR扩增获得酿酒酵母的α-交配因子（α-factor）,并克隆至酿酒酵母胞内表达载体pYES2/CT中,构建了一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor（pYCα）。再将甘露聚糖酶基因（mannase,man）通过酶切、连接克隆至pYCα的α-factor的下游,构建了pYCα-man重组载体检验pYCα的分泌性能和稳定性。结果显示α-factor可引导甘露聚糖酶基因在胞外分泌表达,在曲利本兰培养基上形成明显的水解圈,进一步分析重组菌胞外和胞内酶活,结果显示对照INVSc1/pYCα的两种酶活都未检测到,而INVSc1/pYCα-man具有明显的胞外酶活,未检测到胞内酶活,说明构建的pYCα具有良好的分泌性能;稳定性实验表明重组质粒连续培养150 h仍具有良好的稳定性。     

光活化杀虫剂α-三噻吩的电子自旋共振分析及其对库蚊保护酶系统活性的影响

以淡色库蚊Culex pipiens pallens为试材,初步进行了典型光活化杀虫剂α-三噻吩（α-T）的电子自旋共振（ESR）分析,并研究其对昆虫保护酶系统的影响。ESR分析表明,近紫外光和药剂α-T均可促进活性氧自由基浓度升高,且两者具有协同关系,近紫外光能显著促进α-T增加自由基的作用,处理3 h时试虫自由基总浓度增加了99.6%。近紫外光和药剂α-T对保护酶系统的影响随酶的种类而有所不同,但在近紫外光存在的条件下,α-T对超氧物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活体活性均有抑制作用,且光照3 h时,抑制作用最强。     

产β-葡聚糖酶基因工程菌发酵条件的优化

目的以1株酶产量高、耐热性好的重组大肠埃希菌BL21为材料发酵生产β-葡聚糖酶。方法选用麸皮、豆粕等农副产品配制复合碳源、氮源,优化半合成发酵培养基,并通过正常试验确定最佳培养条件。结果研究得到摇瓶水平产β-葡聚糖酶的最佳培养基（g/L）为：麸皮6.7,玉米粉1.7,豆粕13.8,豆粉13.8,酵母粉7.0,NH4Cl 7.0,Na2HPO4.12H2O3.0,MgSO4.7H2O0.75,CaCl20.5,吐温80 0.8%。通过正交试验确定了产酶最佳初始pH为6.2,装样量为35 mL/250 mL,接种量为1%。采用优化后的工艺,在37℃200 r/min培养过夜,经乳糖诱导6 h后,最高酶活可达到830.7 U/mL,是初始产酶条件的3.4倍。结论该半合成培养基在重组大肠埃希菌产β-葡聚糖酶方面具有很大优势。     

α-萜品醇熏蒸对大麦虫体内抗氧化酶活性的影响

为研究植物挥发性有机化合物α-萜品醇的杀虫活性及作用机理, 本研究采用熏蒸法测定了α-萜品醇对大麦虫Zophobas morio（鞘翅目： 拟步行甲科）4龄幼虫的急性毒性, 并测定了不同熏蒸时间后幼虫体内超氧化物歧化酶（SOD）、 过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性。结果表明： 熏蒸48 h时, α-萜品醇对大麦虫4龄幼虫的LC₅₀和LC₂₀值分别为69.425 μg/L和59.916 μg/L。α-萜品醇（LC₂₀和LC₅₀）处理的4龄幼虫SOD, POD和CAT活性均表现为先升高后降低的趋势。据此推测, α-萜品醇在幼虫体内积累显著影响幼虫体内SOD, POD和CAT活性, 降低虫体内自由基的清除能力, 从而对其产生毒害作用。     

表达酿酒酵母ALAS的重组大肠杆菌胞外5-氨基乙酰丙酸的产量和纯化

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinate,ALA)由5-氨基乙酰丙酸合酶(5-aminolevulinate synthase,ALAS)催化产生。利用重组细菌在大肠杆菌合成ALA已有不少研究。重组真核生物ALAS在大肠杆菌合成ALA的研究没有报道。酿酒酵母ALAS在大肠杆菌重组表达,在摇瓶培养条件下,分析了胞外ALA的产量,重组菌的生长状况和细胞中ALAS的活性,利用两种国产树脂纯化ALA,毛细管电泳分析确定ALA纯度在LB培养基中,初始pH6.5,含有20mmol/L的酮戊酸、20mmol/L琥珀酸和20mmol/L的甘氨酸,37℃下诱导培养12h,胞外ALA的产量为162mg/L培养基。纯化的ALA纯度达到90%。     

芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因工程菌表达条件的优化

对本室构建的生产海藻糖的基因工程菌株,即来自古细菌芝田硫化叶菌B12的新型α淀粉酶基因的工程菌的表达外源蛋白条件进行宿主菌,培养基,诱导时间,诱导温度和诱导菌浓的起始OD600等条件的优化,发现在宿主菌为大肠杆菌DH5α,培养基为改进的LB,诱导时间4小时,诱导温度41℃,OD600为06～08时,基因工程菌ESBAM中新型α淀粉酶的表达量最高,新型α淀粉酶活力也最高,与重组酶MTSase一起作用底物直链淀粉,经HLPC检测在反应产物中有海藻糖的生成。     

臭腹腺蝗肠道中共存的淀粉和纤维素消化酶的纯化、动力学和抑制研究（英文）

【目的】本研究旨在了解臭腹腺蝗 Zonocerus variegatus 中碳水化合物的消化。【方法】依次通过CM-Sepharose CL-6B 阳离子交换、QAE Sephadex A-50阴离子交换以及Sephadex G-100凝胶过滤,对臭腹腺蝗中肠的酶粗提取液（其中α-淀粉酶和纤维素酶的比活性分别为283±1.72 U/mg和 17±0.83 U/mg）进行了纯化。最后通过层析将共存的酶分离成α-淀粉酶和纤维素酶。【结果】这两种酶都是单体,α-淀粉酶分子量为38 kDa ,纤维素酶分子量为21 kDa。α-淀粉酶对淀粉的K_m 值为 13.8±1.29 mg/mL,V_max为3 883±52.25 U/mg pro;而纤维素酶对羧甲基纤维素底物的 K_m 值为5.03±0.57 mg/mL ,V_max为433.00±5.24 U/mg pro 。臭腹腺蝗α-淀粉酶能以不同的效率水解原淀粉,纤维素酶也能不同程度水解各种纤维材料。α-淀粉酶的水解活性在pH 6和40℃下最高,而纤维素酶的水解高活性在pH 9和45℃下最高。【结论】 从番木瓜 Carica papaya 种子中分离到蛋白类抑制剂,发现它们是这两种酶的有效抑制剂,说明这些蛋白抑制剂(CpAI和 CpCI)如果在害虫取食的作物上过量表达,则可能有利于害虫防治。尽管纤维类和淀粉类物质可能都显著提供该害虫的能量需求,但是动力学分析表明臭腹腺蝗更偏向于淀粉类食物。     

耐热过氧化氢酶产生菌的筛选和发酵条件的研究

从59株嗜热放线菌中筛选出一株产胞外过氧化氢酶活力较高的嗜热链霉菌(Thermo-sueptomyces sp．)T485。其产酶的适宜条件为培养温度50℃,培养基pH6—8,碳源麦芽糖,氮源酵母膏,250ml三角瓶装30—50ml培养基,振荡培养48h,产酶可达140u／ml。     

磷酸甘油氧化酶的菌种选育及发酵条件

利用含甘油的斜面培养基连续传代、诱导筛选的方法,从大量链球菌中选育到一株产磷酸甘油氧化酶(L-α-Glycerophosphate Oxidase EC 1.1.3.21)活性较高的粪链球菌(Streptococcus faecalis) GPO 605。培养及产酶最佳条件表明,最适培养基组成(％):酪蛋白胨1,酵母提取物1.5,甘油0.2,葡萄糖0.1,K_2HPO_40.5,无机盐0.25ml,pH7.5。最适培养条件:250ml三角瓶中装100ml培养基,30℃,200r/min旋转摇床振荡培养8h。在最适培养及产酶条件下,每毫升发酵液的酶活力提高10倍以上。     

产SEB金黄色葡萄球菌α-溶血毒素基因缺失菌株的构建

构建产肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B ,SEB)的金黄色葡萄球菌α-溶血毒素（α-hemolysin, α-HL)缺失菌株。首先构建用于α-HL基因敲除的同源重组质粒pMHL-α,经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再通过原生质体转入金黄色葡萄球菌SM-01。含重组质粒pMHL-α的金黄色葡萄球菌SM-01在42℃诱导条件下培养多代,最终筛选出α-溶血毒素基因缺失菌株。经序列分析和血平板溶血实验结果证明最终获得产SEB金黄色葡萄球菌α-HL缺失菌株。为野生型金黄色葡萄球菌的体内遗传操作及构建产超抗原药物金黄色葡萄球菌基因工程菌株提供了一定的理论基础和方法。