人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定

目的：构建人乳头瘤病毒16型与11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒并对其进行鉴定。方法：采用：PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒11型晚期基因L1,并对其进行克隆测序;利用基因重组技术将人乳头瘤病毒16型和11型L1晚期基因共同装入杆状病毒转移载体中,分别位于强启动子Ppolh和弱启动子P10之下;利用酶切和PCR技术对双价重组杆状病毒转移质粒进行鉴定。结果：PCR扩增法获得尖税湿疣组织中感染的人乳头瘤病毒11型的L1基因,得到人乳头瘤病毒16型L1和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒,经酶切电泳鉴定验证重组成功。结论：本研究成功构建了双价重组杆状病毒转移质粒,为进一步构建双价L1蛋白表达系统进而建立双价基因工程亚单位疫苗打下基础。     

利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16/18/33/58亚型L1蛋白

目的:通过昆虫-杆状病毒表达系统获得人乳头瘤病毒(HPV)16/18/33/58亚型的主要衣壳蛋白L1。方法:克隆了HPV16/18/33/58亚型的L1蛋白基因,并采用密码子优化策略进行改造(记为HPV16/18/33/58亚型mL1),将优化基因片段插入pFastBac Dual载体获得重组载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后得到重组Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,Western印迹和SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。结果:获得了表达HPV16/18/33/58亚型mL1蛋白的重组杆状病毒;Western印迹和SDS-PAGE分析表明该重组杆状病毒感染昆虫Sf9细胞后表达mL1蛋白,且mL1蛋白主要分布在细胞中;优化了蛋白表达时间和感染复数,获得目的蛋白mL1的高效表达。结论:多个亚型HPV L1蛋白的克隆表达,为中国优势血清型疫苗的研制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。     

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法,对HPV581L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰,并保留氨基酸不变.选用非复制型重组痘苗病毒为载体,将修饰的L1基因1.5kb和L2基因1.4kb分别插入痘苗病毒表达载体pJSD的7.5k和H6早期启动子之后,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组.经单斑筛选纯化,获得共表达HPV58L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株.该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交分析,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV581L1及L2蛋白.此结果为HPV58型非复制型重组痘苗病毒疫苗人用株的研究打下了基础.     

不同脊髓灰质炎病毒株3CD蛋白酶在昆虫细胞中的表达及其对P1前体蛋白的剪切

目的获得在昆虫细胞中有效表达脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的重组杆状病毒,为制备脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗提供了科学依据。方法将I型脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)的P1基因和3CD基因构建到供体质粒中,通过flash BAC ULTRATM系统制备重组杆状病毒;将Mahoney株的P1基因与Sabin株Ⅲ型的3CD基因组合,用同样方法构建重组杆状病毒。通过接种昆虫细胞草地贪夜蛾细胞(sf-9细胞)对两种病毒进行扩增,再接种昆虫细胞粉纹夜蛾细胞(High five细胞)扩大培养,并通过定量PCR对P1和3CD基因的表达进行验证,利用Western blot检测P1蛋白的表达及被3CD蛋白酶剪切的情况。结果获得了两株稳定表达脊髓灰质炎病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒。其中,重组杆状病毒(Bac U-Mahoney-P1-3CD)在感染细胞后,3CD蛋白酶表达量较低,不能有效剪切P1前体蛋白;而重组杆状病毒(Bac U-Mahoney-P1-Sabin PV3 3CD)感染细胞后,3CD蛋白酶的表达量和对P1前体蛋白的剪切效力都有明显提高(P<0.05)。结论将Mahoney株P1基因和Sabin株Ⅲ型的3CD基因的组合构建重组杆状病毒,可有效地在昆虫细胞中表达P1和3CD基因,并且Sabin株Ⅲ型的3CD蛋白酶可有效地剪切Mahoney株的P1前体蛋白。     

表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建

为研制HPV16的治疗性疫苗,首先将表达质粒pJSA1175与非复制型痘苗病毒NTVJTK+进行同源重组,构建了痘苗重组病毒NTVJLac.再将表达质粒pJSDME6E7R与NTVJLac进行同源重组,构建了表达HPV16 E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7,并对获得的重组病毒进行了鉴定.Southern杂交显示,重组痘苗病毒NTVJmE6E7基因组中有E6和E7基因插入.该重组病毒在人源细胞中不复制.Western blot显示,重组病毒在人源TK-143细胞中能表达E6和E7蛋白.非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7可作为HPV16相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的实验性疫苗株.     

密码子优化型HPV16L1基因在两种昆虫细胞中的表达

目的:提高16型人乳头瘤病毒（HPV16）L1基因在杆状病毒昆虫细胞中的表达水平,为研制预防性HPV疫苗奠定基础。方法:根据昆虫细胞密码子偏性对野生型HPV16L1基因进行改造,利用Bac-to-Bac表达系统获得重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9和High Five。Western blot鉴定表达产物;电镜下观察病毒样颗粒形成。利用ELISA法评价HPV16L1基因的优化效果,探讨L1蛋白表达的最佳条件。结果:在相对分子质量56kDa处出现HPV16L1的特异性条带;电镜下可见病毒样颗粒在昆虫细胞的核内形成;优化型HPV16L1基因的表达水平显著高于野生型。High Five细胞表达的最佳条件为MOI=10,表达时相72h,其L1蛋白表达量至少比Sf9细胞高3倍。结论:密码子优化技术确实能够促进HPV16L1蛋白的高效表达,而High Five细胞表现出的显著优势尤其值得关注。     

HPV 6b L1基因原核表达系统的构建及鉴定

克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建原核表达系统pBAD-HPV6bL1/Top10,酶切鉴定证明重组质粒的正确性。经L-Arobinose诱导后表达HPV6b型L1蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pBAD-HPV6bL1构建成功,诱导后能够表达L1融合蛋白。HPV6bL1重组质粒构建成功,并获得HPV6bL1蛋白,为该蛋白的功能及HPV的基因工程疫苗研究提供了物质基础。     

腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配

为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究。首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1。将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1。用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达。通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs)。用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs。结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs。     

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF.鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFast Bac I载体中,得到重组转移载体pFast-NDF.然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF.再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒.间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用.动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体.本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础.     

人乳头瘤病毒16型E6基因的T—A克隆及在真核细胞中的表达

由于ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白能诱导机体保护性免疫反应,可作为基因治疗的靶抗原。用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了ＨＰＶ１６Ｅ６基因工程蛋白,拟用于宫颈癌细胞系小鼠模型抗癌的免疫治疗。用ＰＣＲ技术从ＨＰＶ１６基因组中扩增获得转化基因Ｅ６的完整ＯＲＦ,按ＴＡ策略将其克隆到自行制备的杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３Ｔ尾载体中,置于杆状病毒ＡｃＭＮＰＶＰｏｌｈ晚期启动子控制之下,用此重组转移质粒ｐＶＬ１３９３Ｅ６与杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６蛋白基因的重组杆状病毒株,并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达为非融合性Ｅ６蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析其分子量约为１８ｋＤ,免疫印迹实验表明,此重组蛋白能被兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体所识别。     

HPV16L1核浆运输的动力学过程

利用增强型绿色荧光蛋白(Enhancegreenflurenscentprotein,EGFP)标记不同的截短型HPV16L1蛋白(Humanpapillomavirustype16L1protein,HPV16L1),分析HPV16L1蛋白核定位信号(Nucleuslocationsignal,NLS)的作用。构建重组pFB-EGFP、pFB-EGFP-HPV16L1、pFB-EGFP-HPV16L1△NLS和pFB-EGFP-NLSHPV16L1p转移载体;在DH10Bac宿主菌内经Tn7转座子介导的同源重组后转染Sf-9细胞,获得重组Ac-EGFP、Ac-EGFP-HPV16L1、Ac-EGFP-HPV16L1△NLS和Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒,感染Sf-9昆虫细胞表达相应截短型HPV16L1融合蛋白;利用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察不同融合蛋白的荧光特性和核浆转运动力学过程。结果发现Ac-EGFP杆状病毒感染的Sf-9细胞内明亮的绿色荧光均匀分布;重组Ac-EGFP-HPV16L1和Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒感染的Sf-9细胞,明亮的绿色荧光主要位于细胞核内;重组Ac-EGFP-HPV16L1△NLS杆状病毒感染的Sf-9细胞,绿色荧光局限于细胞浆内,细胞核内无绿色荧光。说明HPV16L1蛋白羧基端的23个氨基酸(GKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL)具有完全核定位作用,能引导HPV16L1蛋白和EGFP突破核膜屏障进入Sf-9细胞核内。     

Efficient self-assembly of human papillomavirus type 16 L1 and L1-L2 into virus-like particles.

The L1 genes of two human papillomavirus type 16 (HPV16) isolates derived from condylomata acuminata were used to express the L1 major capsid protein in insect cells via recombinant baculoviruses. Both L1 major capsid proteins self-assembled into virus-like particles (VLP) with high efficiency and could be purified in preparative amounts on density gradients. The yield of VLP was 3 orders of magnitude higher than what has been obtained previously, using L1 derived from the prototype HPV16. DNA sequence comparison identified a single nonconserved amino acid change to be responsible for the inefficient self-assembly of the prototype L1. VLP were also obtained by expressing L1 of HPV6, HPV11, and cottontail rabbit papillomavirus, indicating that L1 from a variety of papillomaviruses has the intrinsic capacity to self-assemble into VLP. Coexpression of HPV16 L1 plus L2 by using a baculovirus double-expression vector also resulted in efficient self-assembly of VLP, and the average particle yield increased about fourfold in comparison to when L1 only was expressed. Coimmunoprecipitation of L1 and L2 and cosedimentation of the two proteins in a sucrose gradient demonstrated that L2 was incorporated into the particles. The ability to generate preparative amounts of HPV16 L1 and L1-L2 VLP may have implications for the development of a serological assay to detect anti-HPV16 virion immune responses to conformational epitopes and for immunoprophylaxis against HPV16 infection.     

粗提和纯化的HPV16L1重组蛋白为抗原的ELISA比较

为评价真核及原核细胞表达的HPV16L1粗提蛋白代替纯化的16L1蛋白作为ELISA检测抗原的可行性。实验分别用大肠埃希菌表达的HPV16L1纯化蛋白,表达16L1的大肠埃希菌破碎物及表达16L1的昆虫细胞破碎物作为抗原。在ELISA试验中与抗HPV16L1的单克隆抗体进行反应。结果证实3种包被抗原可以得出非常相近的OD值变化趋势。表明用表达16L1的大肠埃希菌破碎物和表达16L1的昆虫细胞破碎物可以代替纯化的HPV16L1蛋白作为抗原进行ELISA试验。     

用昆虫-杆状病毒系统表达的HPV6型L1蛋白检测尖锐湿疣患者血清中抗体

用杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒6型（human papillomavirus type 6,HPV6）主要衣壳蛋白（major capsid protein,L1）作为抗原,对尖锐湿疣（condyloma acuminata,CA）患者抗体进行检测。采用昆虫杆状病毒系统表达HPV6L1蛋白,通过镍柱亲和层析法获得纯化抗原;以酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测30例CA、20例献血员和10例儿童血清中的HPV6 LI IgG抗体。感染重组杆状病毒的昆虫细胞经SDS-PAGE和Western blot检测,在大约55kD处有明显的外源蛋白表达条带。ELISA结果显示,CA组的血清阳性率为66．7％（20／30）,献血员组的阳性率为15％（3／20）,两组之间有显著性差异（P〈0．05）。22例HPV6型感染的CA患者有15例血清阳性（68．2％）,6例HPV11型CA患者4例阳性（66．7％）,1例混合感染者为阳性,1例HPV16型患者为阴性。女性CA患者的血清抗体阳性率高于男性（P=0．0052）。本研究建立的ELISA体系具有敏感性和针对低危型HPV感染的特异性。这不仅对于HPV血清流行病学研究是有价值的,而且对于临床诊断HPV感染可能具有一定的应用价值。     

Expression of human papillomavirus type 11 L1 protein in insect cells: in vivo and in vitro assembly of viruslike particles.

The L1 coat protein of human papillomavirus type 11 (HPV-11) was expressed in Sf-9 insect cells with the recombinant baculovirus vector Ac11L1. Viruslike particles (VLPs) were identified by electron microscopy in the nucleus and cytoplasm of Sf-9 cells infected with Ac11L1. The L1 protein was purified from Ac11L1-infected insect cells. The purified protein spontaneously assembled in vitro into various aggregates, including particles appearing similar to empty virions. Reaction of VLP-containing insect cell extracts with antisera directed against either denatured or nondenatured capsid epitopes in Western blot (immunoblot) and immuno-dot blot assays suggested that conformational epitopes present in native HPV-11 infectious virions were also present on the baculovirus-produced HPV-11 VLPs. Immuno-dot blot assays using human sera obtained from individuals with biopsy-proven condyloma acuminatum correlated closely with results previously obtained in HPV-11 whole virus particle-based enzyme-linked immunosorbent assays. These morphologic and immunologic similarities to native HPV-11 virions suggest that recombinant VLPs produced in the baculovirus system may be useful in seroepidemiology and pathogenesis studies of genital HPV infection and that they may also be potential candidates for vaccine development.     

Construction of prophylactic human papillomavirus type 16 L1 capsid protein vaccine delivered by live attenuated Shigella flexneri strain sh42

To express human papillomavirus （HPV） L 1 capsid protein in the recombinant strain of Shigella and study the potential of a live attenuated Shigella-based HPV prophylactic vaccine in preventing HPV infection, the icsA/virG fragment of Shigella-based prokaryotic expression plasmid pHS3199 was constructed. HPV type 16 L1 （HPV16L1） gene was inserted into plasmid pHS3199 to form the pHS3199-HPV16L1 construct, and pHS3199-HPV 16L1 was electroporated into a live attenuated Shigella strain sh42. Western blotting analysis showed that HPV 16L 1 could be expressed stably in the recombinant strain sh42-HPV 16L 1. Sereny test results were negative, which showed that the sh42-HPV16L1 lost virulence. However, the attenuated recombinant strain partially maintained the invasive property as indicated by the HeLa cell infection assay. Specific IgG, IgA antibody against HPV16L1 virus-like particles （VLPs） were detected in the sera, intestinal lavage and vaginal lavage from animals immunized by sh42-HPV 16L1. The number of antibodysecreting cells in the spleen and draining lymph nodes were increased significantly compared with the control group. Sera from immunized animals inhibited mufine hemagglutination induced by HPV 16L1 VLPs, which indicated that the candidate vaccine could stimulate an efficient immune response in guinea pig＇s mucosal sites. This may be an effective strategy for the development of an HPV prophylactic oral vaccine.