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采用正交设计优化HPV16L1重组蛋白表达的实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
通过正交试验对构建的人乳头瘤病毒(HPV)16型L1蛋白的重组表达菌株pQE31—HPV16L1/M15(pREP4)进行表达条件的优化,以增加目的蛋白的表达量。实验选取影响蛋白表达的4个主要因素,分别为诱导时间、诱导剂浓度、细菌密度和诱导温度,采用四因素两水平正交试验,通过SDS-PAGE及Western blot测定重组表达蛋白,以Tanon凝胶成像系统分析目的蛋白含量作为检测条件优化效果的指标,所得数据采用SAS软件进行统计分析。实验结果表明在37℃、IPTG0.5mmol/L,菌密度OD600为1.0的条件下诱导4h所得蛋白量最大;经统计正交分析的最佳诱导条件为37℃、0.5mmol/LIPTG和菌密度OD600为1.0的条件下诱导7h。经实验验证,应用正交分析的最佳条件诱导所得目的蛋白量最大,但实际中通常采用诱导4h条件。实验证明正交试验可以用于基因工程菌株蛋白表达条件优化过程,提高工作效率。 相似文献
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HPV 6b L1基因原核表达系统的构建及鉴定 总被引:2,自引:0,他引:2
克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建原核表达系统pBAD-HPV6bL1/Top10,酶切鉴定证明重组质粒的正确性。经L-Arobinose诱导后表达HPV6b型L1蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pBAD-HPV6bL1构建成功,诱导后能够表达L1融合蛋白。HPV6bL1重组质粒构建成功,并获得HPV6bL1蛋白,为该蛋白的功能及HPV的基因工程疫苗研究提供了物质基础。 相似文献
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摘要通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达HPV16L1 VLP,纯化鉴定后利用其建立血凝抑制实验,检测HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。利用重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞表达HPV16L1蛋白,大量获得VLP;优化扩增蛋白的条件并用SDS-PAGE分析鉴定;经氯化铯密度梯度离心法纯化VLP;利用所得VLP建立血凝抑制试验,鉴定制备的HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。优化蛋白表达条件结果显示,当重组杆状病毒感染细胞的MOI=10时目的蛋白表达量最大;按此滴度感染悬浮培养的昆虫细胞,收获、纯化VLP并鉴定其特异性;利用所得VLP建立了血凝抑制实验,鉴定HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制效价为1∶16。建立的血凝实验,可用于鉴定和检测HPV16L1相关抗体,为HPV诊断试剂的开发提供实验基础。 相似文献
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用IPTG诱导目的工程菌pQE31-HPV16L1/M15(pREP4),对表达产物进行SDSPAGE和Western blot分析;用表达的L1蛋白免疫BAL B/C小鼠得到抗血清后,利用真核源性的VLP粗提物验证小鼠抗血清的特异性.利用IMAC金属亲和层析柱纯化L1蛋白.SDSPAGE结果显示表达产物在约57 ku处有蛋白条带;Western blot结果证实此条带可与HPV16 L1蛋白的单克隆抗体反应;纯化后的L1蛋白也同样保留免疫特异性;小鼠抗血清可与HPV16L1 VLP(病毒样颗粒)发生特异性反应,证实重组表达的L1蛋白具有免疫原性.本实验表明HPV16 L1蛋白在工程菌M15(pREP4)中高效表达,为研制HPV16预防性基因工程疫苗和感染的诊断试剂提供了物质基础和技术方法. 相似文献
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人乳头瘤病毒16型L1和L2基因表达产物的鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型晚期基因L1及L2的原核表达质粒,并验证目的蛋白的表达.方法:用限制性酶切及连接的方法构建原核表达质粒pET3a-16 L1和pET3a-16 L2,通过SDS-PAGE及Westen blot检测目的融合蛋白的表达.结果:在大肠菌中诱导表达的L1蛋白分子量约为57 KD,L2蛋白分子量约为90 KD.结论:该实验结果为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研究开发奠定了基础. 相似文献
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