川金丝猴胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因的克隆及序列分析

本实验从金丝猴肝脏细胞RNA中反转录得到cDNA,利用设计的引物M1和M2扩增IGF-Ⅰ基因,并将其克隆到pGEM-T载体上。经筛选、酶切、PCR鉴定、序列分析,证明该片段为金丝猴IGF-Ⅰ基因的cDNA克隆。该片段由521个核苷酸组成,其中包括一个完整的开读框（ORF）,编码一个由153个氨基酸组成的多肽。与GenBank中人、猪、鼠、马、牛、兔、山羊等哺乳动物的IGF-Ⅰ序列比较,其编码成熟肽序列的同源性从93．8％（马）到88．6％（鼠）,开放框序列的同源性从94．4％（人）到88．5％（鼠）。     

山羊卵泡刺激素β-亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA,反转录获得cDNA,以皮cDNA为模板用PCR法扩增目的片段,获得长为390bp的山羊卵泡刺激素β－亚基cNDA片段,与预期的目的片段大小一致。将它克隆至pMD-18-T-Verctor中,随机挑选2个阳性重组子进行测序,并将测序结果与绵羊,牛等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较。结果表明,山羊的卵泡刺激素β－亚基因与绵羊的该基因氨基酸同源性最高,达99．9％,只有1个氨基酸不同,与牛,猪,马,虎,人,大鼠的该基因氨基酸同源性分别为92.5%,91.7%,89.9%,89.1%,86.0%,83.7%。从核苷酸同源性来看,山羊的卵泡刺激素β－亚基因与绵羊该基因的同源性了高,达98％;与牛,猪,马,虎,人,大鼠的核苷酸同源性为95％,90％,90％,88％,86％,84％。结果表明,尽管β－亚基基因有种的特异性,但在哺乳动物中其同源性还是很高的。     

系统发生分析发现牛病毒性腹泻病病毒新基因亚型

本研究对我国首次分离获得的牛源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)毒株Changchun 184(CC-184)和猪源牛病毒 性腹泻病毒ZM-95进行了遗传衍化关系研究。选择主要抗原E2基因为研究对象,首先应用RT-PCR及套式PCR 克隆得到CC-184和ZM-95的E2片段,通过序列测定发现CC-184和ZM-95 E2基因长度分别为1,122bp和1, 125bp,各自编码374和375个氨基酸残基。核酸序列同源性比较和系统发生分析表明2株病毒均属于BVDV-1, CC-184与Osloss亲缘关系最近,都属于已有的b基因亚型,其E2基因同源性达91．8％。而ZM-95的E2基因有 一个特征性的变异区,包含一个密码子序列插入,这一变异区编码了一段有别于其他瘟病毒的五肽氨基酸序列 HYKKK。结果还表明ZM-95与BVDV-1现有的5个基因亚型的亲缘关系均较远,E2基因同源性最高(与Oregon c24v)只有72．4％。而BVDV-1亚型内毒株间的同源性大于85％,亚型间的同源性在69％～75％之间,充分说明 ZM-95是BVDV-1中一个新发现的基因亚型。通常认为猪源BVDV来源于牛,应该与牛源BVDV有十分近的遗 传关系,但是本研究发现ZM-95与其他已知牛源BVDV较低的基因同源性说明猪源BVDV还具有独立的遗传衍 化与传播来源的可能性。     

梅花鹿卵泡刺激素α-亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的母梅花鹿脑垂体中提取总RNA,反转录获得CDNA,以此CDNA为模板用PCR法扩增目的片段,获得长为380bp的梅花鹿卵泡刺激素α-亚基CDNA片段,它将克隆至PMD-18-T-Verctor。随机挑选3个阳性重组子进行测序,并将测序结果与绵羊、牛、猪等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较。结果表明,梅花鹿卵泡刺激素α-亚基基因编码的氨基酸序列与绵羊、水牛的该基因同源性最高,达97%,只有4个氨基酸不同;与牛的该基因同源性达96%。与人的该基因氨基酸序列同源性较低,为75%。其编码的核苷酸序列与绵羊、水牛、牛的同源性最高,达96%,只有14-16个碱基不同,与人的基因核苷酸同源性最低,为84%,总的来说,哺乳动物的卵泡刺激素α-亚基具有很高的同源性。     

山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶生物信息学分析

旨在克隆山羊磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)基因cDNA全序列并进行序列分析.提取山羊睾丸中总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增山羊PHGPx基因cDNA序列并对其生物信息学进行分析.结果表明,山羊PHGPx基因cDNA序列全长844 bp,共编码199个氨基酸;山羊与牛、猪、人和小鼠的氨基酸序列同源性均大于90％;山羊PHGPx蛋白二级结构功能区域属谷胱甘肽过氧化物酶家族,预测23-24和28-29氨基酸位点有潜在的信号肽位点;UPGMA算法构建该物种间分子系统进化树,山羊与牛先聚为一类,再分别与猪、鼠、人、鸡聚类,最后与蜜蜂聚类,与物种动物学分类基本吻合.首次克隆了山羊PHGPx基因,具有GSH-Px家族典型特征,研究结果将为PHGPx基因表达分子调控研究提供一定的理论依据.     

平胸龟Sox基因的克隆和序列分析

本文采用ＰＣＲ技术扩增和克隆了平胸龟的Ｓｏｘ基因,并通过银染测序进行了序列分析。结果显示,平胸龟雌雄个体均能扩增出相同长度的片段,其ＤＮＡ序列与人ＳＲＹ基因的ＨＭＧ－ｂｏｘ同源性达７２．７％,推测的氨基酸序列与ＳＲＹ基因的ＨＭＧ－ｂｏｘ序列同源性为４６．５％,充分显示出Ｓｏｘ基因在系统进化上的保守性。本文为Ｓｏｘ基因的起源和进化研究提供了资料。     

狗肝脏苯甲二氮茸结合抑制因子的cDNA克隆及序列分析

在研究狗抗吗啡活性肽ＰＰＣ过程中,发现它与牛的ＤＢＩ（ｄｉａｚｅｐａｍｂｉｎｄｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）的氨基酸序列有很高的同源性,但尚未见到有关狗的ＤＢＩ的文献报道,为了更好的探讨ＰＰＣ和ＤＢＩ相互间的关系,对狗的ＤＢＩ的ｃＤＮＡ进行了克隆和序列分析。本研究利用大鼠ＤＢＩ的基因片段为探针,从狗肝脏ｃＤＮＡ文库中,筛选得到了一阳性克隆,并进行了全自动和手工测序,得到了ＤＢＩ的全长基因。根据ＥＢＭＬｂａｎｋ序列检索,发现狗的ＤＢＩ核酸序列与牛的同源性为８１％,将其核酸序列翻译成氨基酸序列,进行同源序列比较,结果显示：狗的ＤＢＩ的氨基酸序列与猪、牛、人、酵母ＤＢＩ的同源性分别为８８．５％、８７．４％、８３．９％、４６．５％。研究还发现狗的ＤＢＩ序列与抗吗啡活性肽ＰＰＣＮ端６２个氨基酸只有两个不同,Ｃ端１７个氨基酸序列完全相同。只是ＰＰＣ比ＤＢＩ中间多了２３个氨基酸。     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

扬子鳄4个Sox基因保守区的克隆及序列分析

参考人SRY基因HMG－box的保守区序列,设计一对简并引物,用PCR扩增了扬子鳄Sox基因的HMG－box,并对PCR产物进行了亚克隆和测序。结果在雌雄个体中均筛选到4个不同的Sox基因,无性别差异。其序列与人相应的SOX基因保守区编码序列的相似性分别为91％、96％、100％、96％,分别命名为AS－Sox1,ASSox2,ASSox11,ASSox22。与其他动物相关的Sox/SOX基因的聚类分析结果表明,扬子鳄Sox基因编码的氨基酸序列与进化位置各异的其他动物的Sox/SOX基因编码的氨基酸序列存在高度的同源性,显示出Sox基因在系统进化上的高度保守性。     

两个猪瘟病毒野毒株gp55基因抗原编码区序列的分析及比较

利用反转录－PCR方法扩增了吉林省猪瘟病毒（HCV）两个野毒株gp55基因的主要保护性抗原编码区,并将其克隆到pGEM－T载体中,然后用Sanger双脱氧法测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列。将测定的这两个HCV野毒株的部分序列（350bp）与国内外已知的HCV序列进行比较,结果表明：这两个野毒株的核苷酸序列的同源性为94．9％,氨基酸序列同源性为97．4％,与1985～1992年意大利中部分离4个野毒株的同源性明显高于其它HCV毒株,核苷酸同源性分别为97．2％～98．3％和94.0％～949％,氨基酸同源性分别为98．3％～991％和97.4％～98.3％,而与我国的HCV标准强毒株即石门株的核苷酸同源性仅分别为83.1％和83.1％,氨基酸同源性仅分别为90.6％和91.4％。因此认为吉林省这两个野毒株与意大利中部的4个野毒株具有密切的关系,而与石门株很可能来源不同。     

猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪(BaMei)肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokinesignaling-2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明:首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列(GenBank登录号为EF121242),其长度为822bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。     

猪口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及序列分析

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的决定因素。研究发现,至少有四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8是口蹄疫病毒(FMDV)的受体,其中αv是4种受体的通用亚基。首次从口蹄疫病毒实验感染猪的肺组织中克隆到了通用亚基αv基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪αv亚基基因的编码区含有3141个核苷酸,编码1046个氨基酸,其N-端30个氨基酸为信号肽,其后的胞外域、跨膜区、胞浆域分别由955、29、32个氨基酸组成;胞外域含有11个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)、2个Ca2 结合位点(DX[D/N]XDGXXD)、18个半胱氨酸残基。猪αv基因与牛、人、猕猴、家鼠、鸡、犬的αv基因的核苷酸序列同源性分别为93.3%、91.5%、91.4%、85.6%、73.2%、89.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.3%、94.6%、94.1%、90.8%、81.6%、93.8%,猪与牛αv亚基同源性最高,表明受体αv亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

猪口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及序列分析

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的决定因素。研究发现,至少有四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8是口蹄疫病毒(FMDV)的受体,其中αv是4种受体的通用亚基。首次从口蹄疫病毒实验感染猪的肺组织中克隆到了通用亚基αv基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪αv亚基基因的编码区含有3141个核苷酸,编码1046个氨基酸,其N-端30个氨基酸为信号肽,其后的胞外域、跨膜区、胞浆域分别由955、29、32个氨基酸组成;胞外域含有11个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)、2个Ca²⁺结合位点(DX［D/N］XDGXXD)、18个半胱氨酸残基。猪αv基因与牛、人、猕猴、家鼠、鸡、犬的αv基因的核苷酸序列同源性分别为93.3%、91.5%、91.4%、85.6%、73.2%、89.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.3%、94.6%、94.1%、90.8%、81.6%、93.8%,猪与牛αv亚基同源性最高,表明受体αv亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

高梁叶绿体psaA基因的克隆和核苷酸序列分析

我们克隆了含高梁叶绿体psaA基因的6．7kb Ec0RI酶切片段,进行了限制酶图谱分析和核苷酸序列结构测定,所测核苷酸序列总长为3080bp,其中高梁叶绿体psaA基因序列为2253bp,编码一个含750个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为83000Da。高梁psaA基因的核苷酸序列与玉米、水稻,菠菜的同源性分别为99．4％、96．3％和89．4％;推导出的氨基酸序列的同源性分别为99．3“、98．O％和95．7％。C₄植物与C₃植物比较,由于P 700脱辅基蛋白的第493位氮基酸性质的不同(Gly→Arg,ser),而导致了它们的乡肽在疏水性图谱上的差异。     

黑曲霉N-2植酸酶phy4基因的克隆及其重组酵母表达载体的构建

根据已发表的植酸酶phyA基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以黑曲霉N-2总DNA为模板,扩增出不包含假定信号肽序列的phyA基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为1350bp,与已发表的黑曲霉NRRL3135的phyA基因的同源性为92．4％(不计内含子),编码1个含449个氨基酸残基的蛋白质,推导的氨基酸序列同源性为95．1％。将该基因与分泌型载体pPIC9K连接,构建了植酸酶基因的重组酵母表达载体pPIC9K／phyA。     

新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因的克隆与序列分析

根据已发表的牛流产型布鲁氏菌(B.abrotus)HtrA(High temperature requirment A)基因的核酸序列设计引物,从新疆绵羊种布鲁氏菌(B.ovis)基因组中扩增到了大约1600bp的片段。将该片段纯化后克隆到PBS-T载体上,对所得到的重组质粒进行PCR鉴定、酶切分析后,对克隆的片段进行测序表明,新疆绵羊种布鲁氏菌HtrA基因与发表的牛流产型布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)、猪种布鲁氏菌(B.suis)的HtrA基因核苷酸序列的同源性分别为99.68%、99.81%、99.55%,推导的氨基酸序列也存在很高的同源性。     

猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC2）基因出发,在dbEST数据库中进行同源性搜索,找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证,获得猪TNNC2基因全长cDNA序列,其全长843bp,开放阅读框为201～683bp,编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明,与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93.6％、90.5％,蛋白序列同源性均为97.5%。多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在骨骼肌中表达,并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。     

牦牛CAPN2基因的电子克隆及生物信息学分析

目的:对牦牛CAPN2基因进行电子克隆和序列分析,以期为进一步研究牦牛该基因与其肉质性状相关性以及基因结构和表达奠定理论基础。方法:利用人的CAPNA2基因cDNA序列为探针,在EST数据库进行同源性筛选,运用CAP3进行拼接得到完整序列并结合生物信息学进行序列分析。结果:牦牛CAPN2基因全长3 200bp,包含一个2 103bp的开放阅读框,共编码700个氨基酸;牦牛CAPN2的核苷酸序列与普通牛、羊、马、猪、小鼠、鸡、人相应序列间的一致性分别为99%、97%、90%、87%、85%、79%、90%。经聚类分析,牦牛首先与普通牛聚在一起,然后与羊、猪聚为一类;人与小鼠聚为一类;这两类相聚为一大类后,再依次与马、鸡相聚,其结果与以往的生物学分类结果一致。牦牛CAPN2基因编码蛋白的分子式为C3569H5503N255O1082S26,相对分子质量为79 935.2,理论等电点PI为4.86。结论:牦牛与普通牛、羊、马、猪、小鼠、鸡、人在CAPN2基因的编码序列具有较高有一致性。该基因编码的蛋白为位于细胞质中的水溶性蛋白。     

猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪（BaMei）肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokine signaling -2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明：首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列（GenBank登录号为EF121242）,其长度为822 bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。     

猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪（BaMei）肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokine signaling -2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明：首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列（GenBank登录号为EF121242）,其长度为822 bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。