中药固真方对促甲状腺素受体基因表达的调节作用

促甲状腺素（ＴＳＨ）通过甲状腺细胞膜上的ＴＳＨ受体（ＴＳＨＲ）,产生第二信使ｃＡＭＰ,从而激活ｃＡＭＰ反应性起动子,而使相应的基因获得表达。实验结果表明,在构建有ＴＳＨＲ和糖蛋白激素ｃＡＭＰ反应性起动子以及萤光素基因（Ｌｕｃ）的转染细胞中,经补肾益精中药固真方提取液（１×１０＾－４稀释）处理３￣５ｄ后,可下调ＴＳＨＲ基因的表达,并使ＴＳＨＲ数目减少。提示固真方可调整甲状腺细胞的功能,或许有利于调整     

汉滩病毒感染诱导热休克蛋白70表达

为了解汉滩病毒感染后细胞的应激反应及ＨＳＰ７０的表达与病毒复制的关系,在汉滩病毒Ａ９株感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞后,用免疫组织化学及核酸分子原位杂交法,对细胞ＨＳＰ７０基因的表达进行了检测。结果表明,汉滩病毒感染细胞４ｈｙ后即可诱导Ｖｅｒｐ－Ｅ６细胞表达ＨＳＰ７０,表达可持续至感染后５ｄ且ＨＳＰ７０在细胞内的分布也有改变。提示汉滩病毒可直接诱导ＨＳＰ７０的高表达。     

中药固真方对促甲状腺素受体基因表达的调节作用

促甲状腺素（ＴＳＨ）通过甲状腺细胞膜上的ＴＳＨ受体（ＴＳＨＲ）,产生第二信使ｃＡＭＰ,从而激活ｃＡＭＰ反应性起动子,而使相应的基因获得表达．实验结果表明,在构建有ＴＳＨＲ和糖蛋白激素ｃＡＭＰ反应性起动子以及萤光素基因（Ｌｕｃ）的转染细胞中,经补肾益精中药固真方提取液（１×１０~（－４）稀释）处理３～５ｄ后,可下调ＴＳＨＲ基因的表达,并使ＴＳＨＲ数目减少．提示固真方可调整甲状腺细胞的功能,或许有利于调整甲状腺机能亢进．     

利用GFP示踪细胞内源性P53活性检测DNA损伤

ＤＮＡ损伤的检测对预防癌症和遗传病等非常重要。采用分子克隆技术,将报告基因—绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）置于ＳＶ４０基本启动子调控下,构建成对照载体ｐＳＶ－ＧＦＰ。在ＳＶ４０基本启动子上游插入寡核苷酸Ｐ５３ＲＥ,构建成示踪载体ｐ５３ＲＥ－ＧＦＰ。转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,以ＧＦＰ示踪细胞内源性Ｐ５３的转录激活活性。紫外线照射或Ｈ２Ｏ２处理转化细胞使ＤＮＡ损伤,诱导细胞内源性Ｐ５３的表达。用激光扫描共聚焦成像系统（ＬＳＣＩＳ）对细胞进行红、绿、蓝三色光融合成像,并测定ＧＦＰ经４８８ｎｍ激发后发出的绿色荧光光密度,验证ＧＦＰ示踪Ｐ５３的特异性。ｐ５３ＲＥ－ＧＦＰ转化细胞３Ｔ３－ＲＥＧ经紫外线照射或Ｈ２Ｏ２处理后,ＧＦＰ的表达增高,处理后１ｈｒ光密度即达到最高水平,随后逐渐降低。血清“饥饿”—非ＤＮＡ损伤处理的３Ｔ３－ＲＥＧ细胞,以及经紫外和Ｈ２Ｏ２处理的对照载体ｐＳＶ－ＧＦＰ转化细胞３Ｔ３－ＳＶＧ,ＧＦＰ的表达无明显增强。实验表明：ＧＦＰ示踪内源性Ｐ５３转录激活活性用于检测ＤＮＡ损伤有很高的灵敏度和特异性,适宜推广应用。     

大鼠肝生长发育过程中ACP、AKP、HSC70/HSP68和PCNA的变化(英文)

磷酸酶（ＡＣＰ、ＡＫＰ）在生物的机能分化中起重要作用,热休克蛋白（ＨＳＰｓ）是近几年发现的一类在胚胎发育、细胞生存中起重要作用的分子,无论是胚胎发育还是细胞结构和功能构建都和细胞增殖密切相关,增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）是检测细胞增殖的良好指标。 本实验用组织化学、免疫组织化学、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、酶的原位复性电泳、体视学分析等方法定性和定量分析了酸性磷酸酶（ＡＣＰ）（Ｆｉｇ．１＆２）、碱性磷酸酶（ＡＫＰ）（Ｆｉｇ．４＆５）、构成性热休克蛋白 ７０／诱导性热休克蛋白 ６８（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ６８）（Ｆｉｇ．６）和ＰＣＮＡ（Ｆｉｇ．７＆８, Ｔａｂｌｅ１）在大鼠肝生长发育（从１４天胚胎到成体）过程中的动态变化。结果表明：（１）在大鼠肝生长发育过程中,ＡＣＰ有两个活性高峰期,其时段处于大鼠吃奶和吃饲料起始期（Ｆｉｇ．１＆２）;（２）在ＡＣＰ的第一个活性高峰期时,ＡＫＰ活性降低;而在ＡＣＰ的第二个活性高峰期时,正值ＡＫＰ的活性高峰期（Ｆｉｇ．３）;（３）ＡＣＰ活性高峰期也是ＰＣＮＡ含量高峰期;（４）ＨＳＣ７０／ＨＳＰ６８在刚断奶的幼鼠肝和成体肝中表达量较多,其他时段表达极少。根据上述结果推测：ＡＣＰ和ＰＣＮＡ通过调节细     

钙调素对DNA合成的影响

利用钙调素拮抗剂－－三氟拉嗪对Ｇｏ期小鼠Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２成纤维细胞进入Ｓ期和ＤＮＡ合成进行了研究,Ｇ０期细胞进入Ｓ期时,大量钙调进入细胞核,其水平为Ｇ０期的２倍。ＴＦＰ处理的细胞被阻抑在Ｇ１期,不仅使Ｓ期细胞群体下降,而且３Ｈ－ＴｄＲ掺入ＤＮＡ强度受到明显抑制,同时ＴＦＰ处理的细胞胞腺啶核苷激酶基因表达及ＴＫ活性亦明显下降,但不影响Ｓ期细胞核内的钙调素水平,结果表明钙调素功能之抑制不仅阻抑细胞从     

钙调素对DNA合成的影响

利用钙调素ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ,ＣａＭ）拮抗剂─三氟拉嗪（ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ,ＴＦＰ）对Ｇ０期小鼠Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２成纤维细胞进入Ｓ期和ＤＮＡ合成进行了研究．Ｇ０期细胞进入Ｓ期时,大量钙调素进入细胞核,其水平为Ｇ０期的２倍。ＴＦＰ处理的细胞被阻抑在Ｇ１期,不仅使Ｓ期细胞群体下降,而且３Ｈ－ＴｄＲ掺入ＤＮＡ强度受到明显抑制．同时,ＴＦＰ处理的细胞胸腺嘧啶核苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ,ＴＫ）基因表达及ＴＫ活性亦明显下降,但不影响Ｓ期细胞核内的钙调素水平,结果表明钙调素功能之抑制不仅阻抑细胞从Ｇ１期至Ｓ期的进程,而且对细胞ＤＮＡ合成强度亦有抑制作用．     

正常的和转化的C3H小鼠胚胎成纤维细胞neu基因结构的初步研究

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术并结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交从基因水平对正常和＾３Ｈ－ＴｄＲ恶生转化小鼠胚胎成纤维细胞ＮＣ３Ｈ１０和ＴＣ３Ｈ１０中ｎｅｕ基因进行研究,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交结果表明恶性转化的ＴＣ３Ｈ１０细胞的ｎｅｕ基因出现重排和扩增,ＳＳＣＰ分析未发现ＴＣ３Ｈ１０细胞ｎｅｕ基因跨膜区突变,上述结果说明ＴＣ３Ｈ１０细胞ｎｅｕ基因结构异常可能在跨膜区外,ｎｅｕ基因异常在＾３Ｈ－ＴｄＲ诱导的     

缺氧促进热休克蛋白70在肺动脉平滑肌细胞中的表达

缺氧性肺动脉高压中肺动脉结构重组,中膜平滑肌细胞增殖并迁移,但机制不明。本研究观察缺氧对肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）细胞周期、ＤＮＡ合成及细胞增殖的影响,并通过观察缺氧对ＰＡＳＭＣ热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）表达的影响,初步探讨缺氧的作用是如何介导的。结果表明缺氧可直接或协同内皮质－１促进ＰＡＳＭＣ ＤＮＡ合成及细胞增殖,并可增加ＨＳＰ７０在ＰＡＳＭＣ中的表达。     

丝裂素活化蛋白激酶参与内皮素刺激的兔主动脉平滑肌细胞增生

内皮素（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ,ＥＴ）是已知的体内活性最强的缩血管物质,其缩血管作用由Ｇ蛋白偶联受体所介导。但ＥＴ强大的促血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增生效应的机理尚未完全阐明。本研究选用培养的兔胸主动脉ＶＳＭＣ,探讨丝裂素活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）在ＥＴ促细胞增生中的作用。结果表明：ＥＴ－１呈时间和浓度依赖性地促进细胞摄取￣３Ｈ－ＴｄＲ和激活ＭＡＰＫ,此作用可被蛋白激酶Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ,ＰＫＣ）抑制剂Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＰ）,Ｈ－７和ＥＴ＿Ａ受体拮抗剂ＢＱ１２３所抑制,但不被酪氨酸激酶抑制剂ＨｅｒｂｉｍｙｃｉｎＡ（Ｈｅｒｂ）所抑制,用ＰＫＣ激动剂ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌｍｙｒｉｓｔａｔｅａｃｅｔａｔｅ）预处理ＶＳＭＣ,使其ＰＫＣ活性下调,可显著减弱ＥＴ－１对ＭＡＰＫ的激活能力。本结果提示：（１）ＭＡＰＫ参与ＥＴ－１所致的ＶＳＭＣ增生;（２）ＥＴ－１促细胞增生与激活ＭＡＰＫ的作用是由ＥＴ＿Ａ受体和ＰＫＣ介导的。     

急性冷应激对牦牛乳腺上皮细胞 HSP70 mRNA 表达的影响

本文主要研究了急性冷应激对牦牛乳腺上皮细胞热休克蛋白７０ （Heat stress protein,ＨＳＰ７０） 表达量的影响。采用实时荧光定量ＰＣＲ 技术,以急性冷刺激１０℃ 为典型研究环境,分析了ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 表达的变化规律。结果显示,乳腺上皮细胞在１０℃分别冷处理２ ｈ、４ ｈ、６ ｈ 和８ ｈ,其ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 的表达量变化均不显著（Ｐ ＞０. ０５）;分别在１０℃冷处理２ ｈ、４ ｈ、６ ｈ 和８ ｈ,再复温培养４ ｈ,ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 的表达量均极显著增加（Ｐ ＜０. ０１）,于６ ｈ 达到峰值;在１０℃先冷处理４ ｈ,然后分别复温２ ｈ、４ ｈ、６ ｈ 和８ ｈ,ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 的表达量亦均显著增加（Ｐ ＜０. ０１）,并于４ ｈ 达到峰值。结论：急性冷应激诱导牦牛乳腺上皮细胞ＨＳＰ７０ 表达量的增加不是发生在冷处理过程中,而是发生在复温过程中,并且在一定范围内随冷处理时间的增长表达量增高。     

大鼠自发性高血压与HSP70基因关系的研究

本实验采用热休克蛋白７０核酸分子杂交方法,检测了自发性高血压大鼠和正常血压大鼠离体培养的主动脉平滑肌细胞受热刺激后ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ水平的变化以及整体动物肝组织ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ的水平,并对肝组织基因组ＤＮＡ进行了限制性酶切片段长度多态性分析。结果表明：３７℃培养的ＳＨＲ ＡＳＭＣ及整体ＳＨＲ肝组织ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ的基础表达水平均低于ＷＫＹ鼠,ＳＨＲ ＡＳＭＣ受热刺激（４２℃ １５ｍｉｎ）后２     

流行性出血热尸检组织中热休克蛋白70mRNA的定位及分布

应用核酸原位分子杂交技术研究了国内不同地区３０例流行性出血热患者尸检组织中病毒ＲＮＡ及ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ细胞内定位,同时观察了汉坦病毒感染的ＶｅｒｏＥ６细胞中ＨＳＰ７０的表达情况。结果表明,热休克蛋白７０ｍＲＮＡ在多数组织中均可检测到,分布与病毒ＲＮＡ一致,并且与组织的病理损害有关;体外实验的结果也表明在出血热病毒感染的细胞中有ＨＳＰ７０的高表达。提示热休克蛋白与汉坦病毒的致病以及流行性出血热的发病机理有关。     

正常的和转化的C3H小鼠胚胎成纤维细胞neu基因结构的初步研究

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术并结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交从基因水平对正常和￣３Ｈ－ＴｄＲ恶性转化小鼠胚胎成纤维细胞ＮＣ３Ｈ１０和ＴＣ３Ｈ１０中ｎｅｕ基因进行研究。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交结果表明恶性转化的ＴＣ３Ｈ１０细胞ｎｅｕ基因出现重排和扩增,ＳＳＣＰ分析未发现ＴＣ３Ｈ１０细胞ｎｅｕ基因跨膜区突变。上述结果说明ＴＣ３Ｈ１０细胞ｎｅｕ基因结构异常可能在跨膜区外,ｎｅｕ基因异常在￣３Ｈ－ＴｄＲ诱导的细胞恶性转化过程中可能有重要的作用,ＥＧＦ可促进ｎｅｕ基因表达增高,研究发现在ＥＧＦ持续作用下,ＮＣ３Ｈ１０细胞ｎｅｕ基因甲基化水平无显著变化,说明ＥＧＦ可能是通过其它途径调控ｎｅｕ基因表达增高的,排除了ＥＧＦ通过改变ｎｅｕ基因甲基化水平而调控ｎｅｕ基因表达的可能性。     

利用HSV—TK基因治疗肝癌的离体研究

利用ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ－ＴＫ基因克隆至逆转录病毒载体（ＸＭ－６／ＴＫ）。经ＰＡ３１７细胞包装后，转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２。结果显示，ＸＭ－６／ＴＫ转染ＨｅｐＧ２细胞与野生型相比，其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物－环氧鸟苷（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）后，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。细胞学检查证实，ＧＣＶ处理后，转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示，应用ＨＳＶ－ＴＫ基因治疗肝癌可能为一种治疗肿瘤新的方法     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D的重组活疫苗的建立

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１－１６８株）病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的１．２ｋｂ片段,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的质粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达分子量为５４ｋＤ糖蛋白。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析了重组病毒ＤＮＡ中特异的ｇＤ基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。     

HSV—TK／GCV系统杀伤肝癌细胞的在体研究

目的和方法：将可产生含有ＨＳＶＴＫ基因逆转录病毒的包装细胞与ＢＥＬ７４０２肝癌细胞混合后,接种于裸鼠皮下,复制肝癌模型。确定ＨＳＶＴＫ基因转移后,给予动物注射ＧＣＶ,观察ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统基因治疗实验性肝癌的在体疗效。结果：在体条件下,逆转录病毒可将ＨＳＶＴＫ基因部分转导至肝癌细胞;ＧＣＶ作用后,ＴＫ＋中瘤细胞的生长受到明显抑制;电镜观察发现,ＧＣＶ杀伤ＴＫ＋肿瘤细胞的作用主要体现在细胞核;虽然组化染色分析表明ＴＫ基因转移效率只有１０％～３０％,但测量肿瘤体积显示ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统杀伤肝癌细胞的效果依然明显,故其作用机制可与“旁观者效应”有关。结论：ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ“自杀”基因系统有可能成为基因治疗肝癌的有效方法     

大鼠液压冲击脑损伤热休克蛋白70基因表达的研究

目的：观察大鼠侧位液压冲击脑损伤时ＨＳＰ７０的表达分布特点及时序性变化。方法：雄性ＳＤ大鼠,给以０．２ＭＰａ液压冲击,造成脑损伤,应用免疫组织化学技术观察冲击后不同时间ＨＳＰ７０在脑组织内的表达特点。结果：冲击侧大脑皮层和脑干ＳＨＰ７０阳性神经辊冲击后２ｈ和４ｈ出现,７并逐渐增强直至１２ｈ;冲击后４ｈ,冲击侧海马ＨＳＰ７０免疫阳性细胞开始出现,４￣１２ｈ,海马ＨＳＰ７０免疫阳性细胞数无明显改变。结     

粉防己碱抑制血管平滑肌细胞增殖及对HSP70和p53表达的影响

目的：观察粉防己碱（Ｔｅｔ）对ＶＳＭＣ增殖的作用及对热应激蛋白７０ｋｄ（ＨＳＰ７０）及其ｍＲＮＡ和抑癌基因ｐ５３ｍＲＮＡ的影响。方法：用内皮素建立培养的血管平滑肌细胞增殖模型。采用氚－胸腺嘧啶核苷（［３Ｈ］ＴｄＲ）掺入法流式细胞术,Ｗｅｓｔｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交方法。结果：Ｔｅｔ能逆转内皮素所致的［３Ｈ］ＴｄＲ掺入量增多（Ｐ＜０．０１）,阻止血管平滑肌细胞由静止期（Ｇ０／Ｇ１期）进入ＤＮＡ合成期（Ｓ期）和有丝分裂期（Ｇ２／Ｍ期）,并能逆转内皮素引起的ＨＳＰ７０及ｍＲＮＡ表达增强（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）,ｐ５３抑癌基因ｍＲＮＡ表达减弱（Ｐ＜０．０５）。结论：Ｔｅｔ能抑制血管平滑肌细胞增殖,与ＨＳＰ７０及ｐ５３的调控有关     

人主动脉硫酸乙酰肝系蛋白聚糖对培养人的脐静脉内皮细胞生长…

为探讨硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对内皮细胞生长的作用,用解聚提取及墩子交换柱层析法分离出人主动脉ＨＳＰＧ,用倒置显微镜,细胞计数,及＾３Ｈ－ＴｄＲ参入观察其对培养的第一代人脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）生长的影响,结果表明,（１）倒置显微镜下观察,加入ＨＳＰＧ（１．７０μｇ己糖醛酸／ｍｌ）的ｈＵＶＥＣ生长密度高于对照组（未加ＨＳＰＧ）（２）随着培养时间增加（２４,４８及７２ｈ）根据细胞计数计算