人热休克蛋白70的原核高效表达

将人热休克蛋白基因hsp70片段克隆到高效原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序。将该重组表达载体转化大肠杆菌DH50α,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测,并以凝胶薄层扫描分析表达水平。结果表明,成功地构建了含人hsp70基因的表达载体pMAL-c2X／hsp70,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为110000并具有抗原活性的融合蛋白;改变诱导温度和时间,目的蛋白表达总量及可溶性部分所占比例不同。对人hsp70基因的克隆、表达,并对其进行表达条件的优化,为研究HSP70的结构、功能与临床应用提供了必要条件。     

Hsp70-NP融合蛋白增强诱导HTNV NP特异性CTL的实验研究

本文采用纯化蛋白Hsp70-NP,NP,Hsp70分别免疫C57/BL6小鼠,取各组小鼠脾淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验和细胞毒试验.此外,为了获得细胞毒实验的靶细胞,本文还采用脂质体介导质粒pcDNA3.1/S转染黑色素瘤细胞B16,通过G418筛选稳定克隆,并用RT-PCR,Western blots以及免疫荧光染色证实N蛋白在胞浆中表达.淋巴细胞增殖实验表明,Hsp70-NP,NP组小鼠脾淋巴细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应,而Hsp70-NP组的增殖指数明显高于NP免疫组.细胞毒实验结果表明,LDH的释放具有效应细胞依赖性,Hsp70-NP,NP免疫组脾淋巴细胞均可以特异性杀伤靶细胞B16-N,而Hsp70-NP免疫组的杀伤率显著高于NP免疫组.实验结果显示,Hsp70可以增强NP诱导产生特异性CTL的能力.本研究结果为进一步设计基于NP的合成肽疫苗或基因疫苗提供了重要实验依据.     

汉坦病毒感染诱导乳鼠脑神经细胞表达热休克蛋白70

生后2－3天的昆明乳鼠,每只腹腔接种0.05mL100个半数致死量的陈株汉坦病毒,于接种后不同时间点处死动物,取其脑组织常规固定,石蜡包埋制备5μm连续组织片,用免疫组化法检测组织中的病毒抗原及热休克蛋白70的表达,用共聚焦显微镜观察二者之间的关系。结果发现,感染了病毒的组织能够稳定地检测到热休克蛋白70的表达,而病毒阴性的组织则检测不到热休克蛋白70的表达,且二者有共定位关系,其分布与组织病变一致。这与在病毒感染的VeroE6细胸及EHF病人尸检组织中得到的结果一致,说明病毒感染可诱导热休克蛋白70的表达,后者可能具有保护组织避免或减轻损伤的作用。     

改进的免疫胶体铁细胞化学染色

本文以改进的方法制备了胶体铁。该胶体制备简单,稳定性高,易于抗体标记,在PH7.4时,胶体与抗体IgG稳定结合形成胶体抗体复合物的经以CM-Sephadex C-50代替AmberlightCG50进行标记物的纯化,方法可靠,所制备的胶体铁标记抗体用于免疫细胞化学染色,普鲁士蓝反应清晰地显示出标记抗体与相应抗原的特异性结合部位,与传统的免疫酶及免疫金银方法比较,具有敏感性高,背景干净,呈色鲜明等优点,结合免疫酶及免疫金银染色可用于抗原的双标及多标记。     

原位分子杂交研究肾综合征出血热尸检组织中汉坦病毒M和SRNA的分布

本文以核酸原位分子杂交法研究了国内不同地区ＨＦＲＳ尸检病例组织中病毒ＲＮＡ的分布和定位。结果在１９例病例组织中均可检测到病毒ＲＮＡ。陕西及沈阳地区病例,阳性部位主要是各脏器上皮及实质细胞。江西地区病例,病毒ＲＮＡ主要出现于各脏器组织内血管壁及毛细血管内皮细胞。广州一例,病毒ＲＮＡ主要分布于肝脏灶性溶解性坏死区域,肺泡壁和肾间质血管等部位。病毒ＲＮＡ主要定位于细胞胞浆,呈颗粒状或全浆阳性,也出现于部     

肾综合征出血热人体组织中病毒包涵体的性质及意义的进一步研究

应用免疫组化、原位分子杂交、电镜及免疫电镜等方法进一步对肾综合征出血热人体尸检组织中病毒包涵体（ＩＢ）的抗原、核酸性质和超微结构特点作了进一步观察。结果,在３９例中的２０例尸检病例组织中显示出病毒核蛋白抗原和血凝素抗抗原阳性的ＩＢ,其中包括１６例陕西尸检病例组织中的６例休克期和１例多尿期病例,１７例上海病例中的３例休克期和９例少尿期病例及３例江西病例中的１例休克期病例。ＩＢ主要分布在呼吸道和肺泡、肾远曲小管和集合管、胃肠道、腺垂体、扁桃体、胰腺、前列腺等组织的粘膜上皮和腺上皮细胞及肝细胞和睾丸生精上皮细胞胞浆中,阳性细胞形态基本正常。应用原位分子杂交,可在该组细胞小同时检测到病毒ＲＮＡ,多为胞浆内弥漫阳性,仅少数组织中显示出病毒ＲＮＡ阳性ＩＢ结构。电镜观察阳性组织细胞中出现由大量微丝微管及颗粒样结构组成的ＩＢ结构,其小的病毒颗粒状结构、内质网及纤维丝状结构呈病毒抗原阳性,上述结构位于高尔基体区。结果说明该病毒有感染上皮细胞的特性,对其宿主细胞的致细胞病变作用是极其温和的,且多表现在亚细胞水平。ＩＢ可能是病毒过量表达抗原的堆积或病毒复制部位,而微丝微管结构可能参与病毒的感染过程。     

原位缺口平移标记断裂DNA技术及其在检测流行性出血热尸检和实验动物组织中细胞凋亡和早期死亡的应用

原位缺口平移技术（ＩＳＮＴ）已被用于检测细胞核中ＤＮＡ断裂鉴别尸检组织中细胞的凋亡和坏死断裂、流行性出血热（ＥＨＦ）组织中存在散在单个细胞变性死亡和灶性梗死样坏死,前者带有细胞凋亡的特征。本文以ＥＨＦ肝脏和实验性病毒感染鼠脑组织为例,应用缺口平移法,在ＤＮＡ聚合酶或Ｋｌｅｎｏｗ酶的作用下,将地高辛标记的ｄＵＴＰ掺入合成到ＤＮＡ的断裂部位,通过碱性磷酸酶标抗地高辛抗体免疫组化法显示细胞ＤＮＡ的断裂,检测和鉴别细胞的凋亡和坏死。为分析死后解剖时间间隔及组织固定时间对该方法的影响,本文选用死后２～１４０ｈ尸检、经常规固定石蜡包埋后存放１０～３５年的标本和在１０％福尔马林固定了１０～３５年之后再进行常规处理的标本。实验时用蛋白酶Ｋ（ＰＫ）消化前后对比并分别在标记反应液中略去ＤＮＡ聚合酶作为阴性对照,用ＤＮＡ酶消化组织人为制造ＤＮＡ缺日作为阳性对照。结果发现,未经ＰＫ消化的组织,仅灶性肝细胞核ＩＳＮＴ标记阳性,经ＰＫ消化后,散在的带有凋亡特征的肝细胞胞核也出现阳性,灶性肝细胞胞核标记染色增强,但无论是蛋白酶消化与否,明确梗死样坏死的肝细胞均不被标记。结果还发现,死后２～２４ｈ内尸检组织和长时间（１０～３４年）存放的石     

应用鼠单抗显示鼠组织中特异性抗原的免疫细胞化学方法

作者在应用小鼠抗肾综合征出血热病毒(HFRSV)单克隆抗体(MAbs)免疫细胞化学法定位HFRSV自然感染大鼠组织中的病毒抗原时发现,部分大鼠组织的特异性HFRSV MAbs的染色切片及无关MAb对照和空白对照染色的切片中均出现血液。血细胞,血管壁,单核吞噬细胞系统,肾小球毛细血管及散在的心肌和肝细胞阳性,说明组织中有交叉反应。免疫双扩试验,羊抗鼠IgG桥抗可与大鼠Ig产生免疫沉淀反应,提示,组织中的交叉反应是由桥抗与大鼠细胞中本身存在的Ig(EIg)反应所致。为了避免EIg对特异性病毒抗原染色的干扰,我们以HFRSV MAbs预先分别与二抗羊抗鼠IgG结合,再用正常鼠Ig结合可能存在的二抗中尚未结合MAbs的Fab结合位点,制成一抗分子复合物,并以此作为一个新的相当于羊源性单克隆抗体孵育组织,以抗羊抗体连接羊PAP的多重PAP法显示一抗分子复合物的特异性抗原结合位点,结果显示该方法具有一抗的特异性,以有多重PAP法的敏感性,可有效的避免因EIg产生的交叉反应。用小鼠抗大鼠Kappa轻链MAb按同样方法制备一抗分子复合物用于染色证实,产生交叉阳性的部位确为大鼠组织中的Ig。病毒抗原及Ig的定位结果说明,HFRSV自然感染大鼠组织中的病毒抗原有广泛分布,也存在免疫复合物,但后者有别于HFRS人体组织的分布,另外,心肌及肝细胞Ig阳性说明该组织存在因HFRSV感染所造成的组织损伤,该损伤可能与机体的免疫反应有关。     

应用单克隆抗体免疫细胞化学法分析尸检组织中肾综合征出血热病毒G2，NP及HA结构蛋白抗原

本文应用15株分别抗肾综合征出血热(HFRS)病毒糖蛋白(Glycoprotein Ⅱ G2),核蛋白(Nuclcocapsid,NP)及血凝素(Hemagglutinin,HA)抗原的单克隆抗体免疫细胞化学方法对19例HFRS尸检病例的16种组织中的病毒抗原进行了定位和分布的研究及抗原分析。结果表明,死于早期HFRS人体组织内病毒抗原量大,分布广泛,主要以可溶性和颗粒性两种形式存在,前者存在于细胞内和细胞外,呈G2,NP及HA抗原阳性,是参与形成免疫复合物的主要抗原形式;后者是以单纯病毒NP或HA抗原阳性的病毒包涵体(IB)形式存在于细胞内,是病毒直接作用所致细胞病变的标志,IB的广泛分布但只有极个别阳性细胞发生坏死,说明该病毒具有泛嗜性感染和弱致细胞病变能力的特性。抗原分析结果显示,组织细胞中病毒抗原的表达及其抗原量受宿主细胞的种属,组织结构特点及病期的影响,也存在个体差异以及因感染病毒株或血清型不同产生差异的可能性。病毒抗原染色形态学证实,NP上具有HA抗原位点,其抗原决定簇有三类,其中的某些抗原决定簇可因病毒宿主动物或细胞的种属不同,表达也不同。HA抗原在人体组织细胞中的高表达和广泛分布也说明HFRSV对人体有很强的侵袭力。     

汉滩病毒核蛋白与热休克蛋白GRP94、HSP27的相互作用

为研究汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)感染诱导乳鼠脑组织热休克蛋白GRP94、HSP27与病毒蛋白的相互关系,选出生2～3d的昆明乳鼠实验性感染汉滩病毒,取8d后发病乳鼠脑组织部分制石蜡切片,用免疫组化结合共聚焦显微镜检测组织中病毒抗原及GRP94、HSP27的表达,部分制匀浆液,用ELISA、免疫共沉淀方法分析病毒抗原和GRP94、HSP27的关系.结果示汉滩病毒感染诱导乳鼠脑组织神经细胞高表达GRP94且与细胞内病毒抗原有共定位关系,但未见HSP27诱导高表达;免疫共沉淀显示汉滩病毒核心抗原(HINV-NP)与GRP94、HSP27呈非共价复合物形式存在.该结果为进一步探讨HSPs在病毒感染复制中的作用以及抗病毒感染方面提供了有意义的实验资料.