黄曲霉毒素B_1抗独特型抗体的制备和应用研究II.抗独特型抗体应用

以抗独特型抗体(anti-idiotypeantibody,Ab2)的酶切片段Fab2替代黄曲霉毒素B1(AFB1)建立一种不需要使用AFB1的无毒酶联免疫吸附(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)试剂盒,研究该试剂盒特异性、稳定性和AFB1的加标回收,并将该试剂盒用于农产品和饲料中AFB1的检测。结果表明,该试剂盒具有和常规ELISA试剂盒一样的特异性和加标回收能力,无毒试剂盒和常规试剂盒一样都可以用于农产品和饲料中AFB1的检测,并且两种试剂盒的检测结果并无显著差异,无毒ELISA试剂盒在适当处理后,40C放置3个月和-200C放置5个月,以间接非竞争ELISA测定的吸光值分别是起始时的85%和87%。     

黄曲霉毒素B1抗独特型抗体的制备和应用研究II.抗独特型抗体应用

以抗独特型抗体(anti-idiotypeantibody,Ab2)的酶切片段Fab2替代黄曲霉毒素B1(AFB1)建立一种不需要使用AFB1的无毒酶联免疫吸附(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)试剂盒,研究该试剂盒特异性、稳定性和AFB1的加标回收,并将该试剂盒用于农产品和饲料中AFB1的检测。结果表明,该试剂盒具有和常规ELISA试剂盒一样的特异性和加标回收能力,无毒试剂盒和常规试剂盒一样都可以用于农产品和饲料中AFB1的检测,并且两种试剂盒的检测结果并无显著差异,无毒ELISA试剂盒在适当处理后,40C放置3个月和-200C放置5个月,以间接非竞争ELISA测定的吸光值分别是起始时的85%和87%。     

黄曲霉毒素B1抗独特型抗体的制备和应用研究I抗独特型抗体的制备和性质研究

以黄曲霉毒素B1(AFB1)与牛血清蛋白（BSA)的连接物AFB1-BSA注射免疫兔子获得抗AFB1抗血清,经(NH4)2SO4沉淀、酶切处理与亲和层析分离纯化后,得到抗AFB1独特型抗体Ab1及其酶切片段Fab1,然后再将Fab1注射免疫BALB／c小鼠,得到抗(抗AFB1)独特型抗体Ab2及其酶切Fab2。研究了Ab2和Fab2的性质,结果表明,Ab2和其Fab2部仅与Ab1及其Fab1反应,而不和抗桔霉素等其他抗体反应,有较好的特异性。以AFB1与卵清蛋白(OV)的连接物AFB1-OV为包被抗原,Fab1为反应抗体,Ab2和Fab2为竞争抗原,达到50％的竞争抑制率时,Ab2和Fab2的浓度分别为3．98ug／ml和1．12ug／ml;而以Ab2和Fab2为包被抗原,Fab1为反应抗体,AFB1为竞争抗原,达到50％的竞争抑制率时,AFB1的浓度分别为44．67ug/L和6.31ug／L,这表明无论是Ab2还是Fab2都和AFB1有很好的内影像关系,可以作为AFB1的替代品用于AFB1的免疫学检测。但是相对而言,由于Fab2的分子量小,反应时的空间位阻小,所以Fab2更适合于用作AFB1的替代品。     

黄曲霉毒素B_1抗独特型抗体的制备和应用研究I 抗独特型抗体的制备和性质研究

以黄曲霉毒素B1(AFB1)与牛血清蛋白(BSA)的连接物AFB1-BSA注射免疫兔子获得抗AFB1抗血清,经(NH4)2SO4沉淀、酶切处理与亲和层析分离纯化后,得到抗AFB1独特型抗体Ab1及其酶切片段Fab1,然后再将Fab1注射免疫BALB/c小鼠,得到抗(抗AFB1)独特型抗体Ab2及其酶切Fab2。研究了Ab2和Fab2的性质,结果表明,Ab2和其Fab2都仅与Ab1及其Fab1反应,而不和抗桔霉素等其他抗体反应,有较好的特异性。以AFB1与卵清蛋白(OV)的连接物AFB1-OV为包被抗原,Fab1为反应抗体,Ab2和Fab2为竞争抗原,达到50%的竞争抑制率时,Ab2和Fab2的浓度分别为3.98ug/ml和1.12ug/ml;而以Ab2和Fab2为包被抗原,Fab1为反应抗体,AFB1为竞争抗原,达到50%的竞争抑制率时,AFB1的浓度分别为44.67ug/L和6.31ug/L,这表明无论是Ab2还是Fab2都和AFB1有很好的内影像关系,可以作为AFB1的替代品用于AFB1的免疫学检测。但是相对而言,由于Fab2的分子量小,反应时的空间位阻小,所以Fab2更适合于用作AFB1的替代品。     

自制抗人磷脂酶A2受体抗体ELISA试剂盒的临床应用评价

旨在自制能够辅助诊断原发性膜性肾病的抗磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测试剂盒;通过包埋HEK293细胞表达的重组抗原、患者血清与抗原反应、酶的催化放大效应测定样本中抗PLA2R IgG滴度,通过临床数据分析、与市售试剂盒的比对,评价该试剂盒的临床应用价值及性能。研究发现自制试剂盒与国外试剂盒检测阳性一致率97.2%,阴性一致率100%;检测限不高于2 RU/mL;准确度的测量相对偏差在±15%区间内;试剂盒线性范围在2–500 RU/mL,线性相关系数r值不低于0.990 0;重复性检测的变异系数(CV)小于15%;于37℃恒温箱放置1周后,2–8℃放置1年后,检测性能无明显改变。结果表明自制试剂盒对血清抗PLA2R抗体检测的敏感性、特异性均与德国欧蒙公司(E150522BD)试剂盒相近,诊断效能高,可用于原发性膜性肾病辅助诊断。     

黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测技术研究

【目的】制备黄曲霉毒素B1单克隆(AFB1)抗体,建立间接竞争ELISA检测方法用于污染样品中AFB1的检测。【方法】用碳二亚胺法制备黄曲霉毒素B1的完全抗原AFB1-BSA后免疫Balb/c小鼠,经过细胞融合和克隆化筛选获得抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备抗体,通过间接ELISA方法分别测定抗体亚类和效价。经优化实验条件,建立稳定的间接竞争ELISA检测方法,并用于检测饲料样品中的黄曲霉毒素B1。【结果】获得4株稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选择3B9细胞株制备抗体,测定抗体亚类为IgG1,效价为1:204 800,与黄曲霉毒素B2、G1、G2和M1的交叉反应率分别为2.2%、33.9%、1.8%和4.1%,与赭曲霉毒素A、伏马毒素和玉米赤霉烯酮几乎不存在交叉反应。以此单抗构建了AFB1间接竞争ELISA检测方法,在AFB1浓度为1.04?25.00 μg/L范围内呈线性(R2=0.993 1),检测限为1.04 μg/L,半数抑制率(IC50)为6.03 μg/L,平均加标回收率在线性范围内可达85%?120%,变异系数均小于10%。【结论】通过饲料样品检测证实,该方法与进口ELISA试剂盒检测一致性良好,可用于实际样品中黄曲霉毒素B1的快速筛检。     

研究报告：金抗体替代ELISA中的天然抗体用于溶菌酶检测

目的酶联免疫吸附测定(ELISA)被广泛用于抗体或抗原的检测,并被视为临床实践中的金标准,可提供相对可靠、灵敏和特异的检测结果。ELISA的本质是抗原与相应抗体之间的特异性相互作用。然而,天然抗体固有的不稳定性是ELISA的一个难以克服的弱点,并可能导致检测结果的重现性差甚至错误的诊断结果。本课题组先前应用构象工程方法开发了一种基于金纳米粒子的人工抗体(简称金抗体)。金抗体可以像天然抗体一样特异性地与抗原相互作用,并且具备远优于天然抗体的稳定性。出色的稳定性使金抗体可能成为天然抗体更好的替代物,用于ELISA中。方法经过必要的优化并与辣根过氧化物酶(HRP)耦联后,制得酶标金抗体10HRP-(Au-400P1),然后用酶标金抗体代替天然酶标抗体用于ELISA检测中。结果通过一系列的实验证明,抗溶菌酶金抗体可用于ELISA特异性检测1～16 mg/L范围内的鸡蛋清溶菌酶(HEWL)样品。结论金抗体可以替代天然抗体用于ELISA检测,并具有优于传统ELISA法的检测准确性和一致性。     

抗黄曲霉毒素B1单链抗体的筛选和鉴定

目的】从Tomlinson（I）噬菌体抗体库中筛选人源化抗黄曲霉毒素B1单链抗体蛋白（scFv）并进行鉴定。【方法】分别采用甘氨酸洗脱、胰蛋白酶洗脱、游离AFB1竞争洗脱和AFB1竞争洗脱加胰蛋白酶处理4种方法对噬菌体抗体进行特异性洗脱。将筛选到的噬菌体阳性克隆转化到大肠杆菌 (Escherichia.coli ) HB2151,IPTG诱导表达scFv。ELISA检测和基因序列测定。【结果】比较四种洗脱方法,发现用AFB1竞争加胰蛋白酶洗脱筛选到阳性克隆的的概率最高,把此方法得到的阳性噬菌体克隆转化大肠杆菌HB2151表达,竞争性ELISA检测得到2个能特异性结合游离的AFB1阳性克隆。间接性ELISA测定相对亲和力分别为0.4 μg/mL和0.7 μg/mL 。测序证实scFv属于人类免疫球蛋白可变区。【结论】利用噬菌体展示技术获得高特异性抗黄曲霉毒素B1的人源化单链抗体,本实验方法可以为其它抗半抗原重组抗体的筛选提供一定的借鉴意义。     

尿微量白蛋白ELISA诊断试剂盒稳定剂效果研究

目的:观察尿微量白蛋白诊断ELISA试剂包被稳定剂和酶结合稳定剂的效果。方法:定期检测分别保存于37℃和4℃的尿微量白蛋白试剂盒,并对其稳定性进行评估。结果:该尿微量白蛋白诊断试剂包被稳定剂和酶结合稳定剂可以使尿微量白蛋白试剂盒在2~8℃条件下放置6个月以上。     

兔抗金黄地鼠酶标抗体的制备及应用

目的 纯化金黄地鼠血清IgG,制备兔抗金黄地鼠酶标抗体(IgG-HRP),开展金黄地鼠仙台病毒的初步检测.方法 采用亲和层析纯化法纯化金黄地鼠IgG,用SDS- PAGE电泳测定IgG纯度并制备兔抗金黄地鼠IgG抗体(second antibody,Ab2);用免疫双扩散法检测抗血清效价后,再用亲和层析纯化抗血清IgG( Ab2);采用改良过碘酸钠标记法制备兔抗金黄地鼠酶标抗体( rabbit anti-hamster IgG-HRP);用直接ELISA和Western-blot法对兔抗金黄地鼠IgG酶标抗体进行工作浓度测定;应用金黄地鼠酶标抗体对金黄地鼠仙台病毒进行酶免检测(IEA).结果 金黄地鼠血清IgG纯度达95％;兔抗金黄地鼠IgG抗体(Ab2)免疫双扩散效价为1(:)64;兔抗金黄地鼠IgG -HRP经直接ELISA和Western-Blot测定工作浓度分别为1∶5000和1∶2000;酶免(IEA)效价为1:2000.结论 高效快速纯化了金黄地鼠IgG,制备了金黄地鼠IgG-HRP,为金黄地鼠病原微生物的血清学检测提供了条件.     

猪O型口蹄疫病毒抗体化学发光酶联免疫检测方法的建立

表达并纯化猪O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1重组蛋白作为检测抗原,建立了一种快速检测猪O型口蹄疫病毒抗体的化学发光酶联免疫(CLEIA)检测方法。建立的VP1-CLEIA方法特异性为100%,板内变异系数在1.10%–6.70%之间,板间变异系数在0.66%–4.80%之间,具有较好的特异性和重复性,且灵敏度高于ELISA方法。通过对山东、辽宁、河北地区采集的250份临床血清的检测表明,该方法与间接ELISA试剂盒的符合率为93.50%,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率为94.00%,表明本次建立的VP1-CLEIA检测方法可以用于猪O型FMDV感染或疫苗免疫后抗体水平检测。     

人巨细胞病毒IgG抗体(ELISA)检测试剂盒稳定性观察

目的观察人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)IgG抗体(ELISA)检测试剂盒的稳定性。方法将HCMV IgG抗体(ELISA)检测试剂盒分别以不同时间放置于2~8℃和37℃,检测试剂盒的外观、阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、重复性和检测限,并对其进行稳定性(实时稳定性、加速破坏稳定性、开瓶稳定性、运输稳定性)的观察及初步应用。结果 3批实验用试剂盒实时稳定性和3批试生产试剂盒加速破坏稳定性、开瓶稳定性、运输稳定性试验中,外观均合格,阴性参考品符合率及阳性参考品符合率均为100%,最低检出限参考品均能检出。3批实验用试剂盒实时稳定性检测重复性良好,CV值均≤15.00%。3批试生产试剂盒在37℃条件下放置6 d后,CV值分别为7.94%、7.16%、4.66%;开瓶后分别置于2~8℃冰箱0w、1w、2w、3w、4w,CV值均≤1 5.00%;运输至上海,CV值分别为2.59%、3.12%、2.37%;运输至海南,CV值分别为4.89%、2.65%、2.33%。样品反复冻融5次后,试剂盒检测稳定性良好。结论 HCMV IgG抗体(ELISA)检测试剂盒具有良好的稳定性,在2~8℃条件下至少可保存15个月。     

兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用

目的建立检测兔病毒性出血症(RHD)血清抗体的间接ELISA方法并组装成试剂盒,进行初步应用。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯RHDV病毒粒子作为包被抗原,优化反应条件和筛选试剂,建立间接ELISA检测方法,组装试剂盒并对其总体性能进行评价。结果试剂盒敏感性为血凝抑制试验的4~32倍,重复性和特异性良好,保质期为4℃3个月。对105份兔血清进行随机检测,与血凝抑制试验的复核率为95%。结论本试剂盒可以在检测和科研中初步应用。     

脱落酸抗体的抗独特型抗体的制备与鉴定

用ABA多克隆抗体(Ab_1)以金黄色葡萄球菌菌体(SPA)作为载体,免疫家兔,制备的抗独特型抗体(Ab_2)初步纯化后用ELISA试验鉴定其特异性的结果表明,该抗独特型抗体具有良好的特异性,能阻断ABA抗体对ABA的结合反应,并与ABA结合蛋白结合,暗示其有模拟抗原的作用。 Jerne的免疫网络学说认为,特异性抗体(Ab_1)可变区中的独特型决定簇(Id)可诱导抗独特型抗体(Ab_2)的产生,Ab_2中的一部分可以模拟抗原的作用。Sege和Peterson提出,     

睾酮人工抗原的合成及酶联免疫方法的建立

为检测食品中睾酮的残留,合成睾酮人工抗原并建立一种用于检测睾酮的酶联免疫方法(ELISA)。通过混合酸酐法将肟化的睾酮与鸡卵清蛋白偶联,合成人工包被抗原,与睾酮单克隆抗体竞争结合,根据光密度(OD)值对睾酮定量。结果表明,经紫外吸收、红外光谱、SDS-PAGE电泳验证人工抗原合成成功,建立的间接竞争酶联免疫标准曲线线性范围为1～25μg/L,最低检测限为0. 261 7μg/L。对该检测方法进行稳定性测定,将储存3、7、10、14 d的试剂盒进行标准品测定,所得批间差异均小于5%。同时进行样品加标回收试验,平均加标回收率在87. 51%～102. 83%,说明建立的睾酮ELISA检测具有很高的准确度,可以应用于实际样品中睾酮的检测。本研究为进一步开发睾酮酶联免疫检测试剂盒检测食品中睾酮残留奠定基础,为保障我国肉制品质量安全提供一种有效的技术手段。     

抗人IgG和抗人IgM单克隆抗体的特性鉴定及应用

目的:制备特异性高的抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体,并应用于临床血清学检测试剂盒,为其提供优质的二抗。方法:以人Ig G和Ig M为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤融合和筛选技术制备抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体;经体内诱生法制备腹水并纯化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹进行交叉筛选和特异性鉴定,并对筛选出的单抗进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,再与市售的检测病原微生物抗体试剂盒中对应的HRP标记的二抗(抗人Ig G和抗人Ig M)做对比分析。结果:筛选到2株可稳定分泌抗人Ig G单抗和2株抗人Ig M单抗,经交叉反应、Western印迹及对比实验分析,证明这4株单抗效价高、特异性好,比临床试剂盒中的酶标二抗特异性强、敏感度高。结论:获得4株特异性强、敏感度高的抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体,可为各种病原微生物血清学的检测提供二抗试剂,具有良好的应用价值。     

兔抗麻雀IgY酶标抗体的制备

目的制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗麻雀IgY抗体,为禽类血清学检测体系的建立提供技术储备。方法硫酸铵盐析法粗提麻雀血清IgY,进一步在SDS-PAGE上分离后,切下带有目的条带的凝胶作为免疫原,免疫实验兔制备抗血清,Protein-A柱亲和纯化兔抗IgY血清IgG,,使用改良过碘酸钠法制备酶结合物。ELISA检测酶标抗体的工作浓度,western blotting检测酶标抗体的特异性。结果硫酸铵盐析法粗提IgY,可去除部分杂蛋白,SDS-PAGE上分离后切下带有目的条带的凝胶,可以得到足够纯度的抗原,将带有IgY的凝胶作为抗原免疫后获得的抗血清经Protein-A纯化后,二抗在SDS-PAGE上鉴定,纯度达到99%以上。改良的过碘酸钠法标记获得的抗体浓度为1.008 mg/mL,ELISA检测酶标抗体效价为1∶1000。Western blotting鉴定抗体具有特异性。结论获得了优质可靠的兔抗麻雀IgY酶标抗体。     

基于TbpA蛋白的副猪嗜血杆菌抗体间接酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glasser’s Disease)的病原体,抗生素治疗和疫苗接种对于防控该病效果不明显,建立快速、准确的抗体检测方法尤为重要。【目的】利用表达纯化的HPS转铁结合蛋白A(TbpA)建立检测HPS抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。【方法】PCR扩增HPS的tbpA基因并与原核表达载体pET-SUMO连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入Escherichia coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定产物。以纯化的TbpA蛋白作包被抗原,通过各种反应条件优化,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,并进行临床应用与评价。【结果】该方法的最佳条件:包被抗原浓度为5μg/mL,4℃过夜;5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h;血清稀释度为1:1600,37℃孵育45 min;酶标二抗稀释度为1:5000,37℃作用30 min;显色时间为37℃ 5 min。该方法可特异性检测HPS抗体,阳性血清稀释至1:12800仍可检出,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应,批内及批间变异系数均小于10%,与全菌体包被间接ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western Blot比较,该方法总符合率分别为90.00%、86.67%和90.00%,其中阳性符合率分别为90.38%、88.46%和92.00%,阴性符合率分别为87.50%、75.00%和80.00%。该方法检测免疫抗体阳性率为80.00%,感染抗体阳性率为19.50%。【结论】基于TbpA蛋白建立的HPS抗体间接ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为HPS的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段。     

抗A型肉毒神经毒素中和抗体间接ELISA的建立

目的建立间接ELISA,检测血清中抗A型肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin type A, BoNT-A)中和抗体。方法以纯化的BoNT-A作为包被抗原,抗BoNT-A兔血清作为一抗,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A, SPA)作为二抗,结合实验设计,建立检测血清中抗BoNT-A中和抗体的间接ELISA,验证该方法的特异性、灵敏度和重复性,并与经典动物中和试验法检测抗BoNT-A中和抗体的结果进行比较。结果①间接ELISA条件的建立与优化,使用2.50μg/mL纯化的BoNT-A抗原包被,4℃过夜;1%明胶作为封闭剂,37℃封闭2 h;确定一抗优化条件:反应条件为1∶5 000稀释,37℃孵育90 min;二抗优化条件:反应条件为1∶10 000稀释,37℃孵育90 min;加入底物37℃显色10 min,加终止液终止后,用酶标仪测定A_(450 nm)值;②经过验证该方法特异性好,所包被抗原与抗伤寒杆菌兔血清、抗破伤风毒素兔血清、抗B型肉毒毒素兔血清、抗E型肉毒毒素兔血清、抗F型肉毒毒素兔血清均无交叉反应;灵敏度高,当抗BoNT-A兔血清按照1∶320 000稀释时,检测结果依然呈阳性;重复性良好,批内重复性验证CV分别为2.62%、1.40%、2.14%,变异系数均小于3%,批间差异无统计学意义(P=0.103,P>0.05);该方法检测抗BoNT-A中和抗体检出限为抗-0.03 LD_(50)/mL,大约是经典动物中和试验法的1/30,显著地提高了检测灵敏度。结论建立了一种可用于检测血清中抗BoNT-A中和抗体的间接ELISA。     

动物组织中磺胺二甲嘧啶残留ELISA试剂盒研制

采用重氮化法和戊二醛法,将磺胺二甲嘧啶分别与牛血清白蛋白和辣根过氧化物酶偶联制备了免疫原和酶标半抗原,免疫兔获得了特异性抗体,成功建立了相关动物产品中磺胺二甲嘧啶残留ELISA定量检测方法及商品化试剂盒,并对试剂盒的灵敏度、准确度、精密度和稳定性进行了研究。试剂盒检测线性范围为62.5~0.54 ng/mL。在待测样品中各添加500、200、100、50 ng/g SMZ,测试的回收率平均为89.0%~134.8%;试剂盒测定结果与色谱的平均符合率99.8%~126.0%;对比定性测试15份色谱检测为阴性的样品,均未出现假阳性。试剂盒存放在37℃10 d和2~8℃5个月,质量稳定。