赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮-二联胶体金免疫层析试纸条的制备及应用

【背景】真菌毒素为真菌的有毒次级代谢产物,混合污染时毒性显著增强,可对人类和动物健康造成严重伤害。制备二联胶体金免疫层析试纸条,实现对常见真菌毒素混合污染的快速监测,具有重要意义。【目的】制备赭曲霉毒素A (Ochratoxin A,OTA)和玉米赤霉烯酮(Zeralenone,ZEN)金标单克隆抗体,基于免疫层析原理,采用竞争反应模式,建立二联胶体金免疫层析检测法用于污染样品中OTA和ZEN的同时快速检测。【方法】采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,并标记获得两种真菌毒素金标单克隆抗体,通过优化相关条件,建立稳定的二联胶体金免疫层析检测方法,用于同时检测谷物和饲料样品中的OTA和ZEN。【结果】制备的OTA和ZEN二联胶体金试纸条对OTA和ZEN的检测限分别为0.625 ng/mL和1.25 ng/mL,且与谷物和饲料中其它真菌毒素(黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、桔青霉毒素、展青霉毒素和呕吐毒素)均无交叉反应,人工添加试验结果准确。对天然样本检测结果表明该方法与LC-MS/MS一致性良好。【结论】本研究制备的二联胶体金试纸条可用于实际样品中OTA和ZEN的同时快速筛查。     

基于CdSe阳离子交换的玉米赤霉烯酮新型荧光免疫检测方法的建立及应用

作为镰刀属真菌的次级代谢产物,玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)具有强烈的生殖毒性和免疫毒性,严重威胁动物和人类健康。本研究通过采用羧基修饰的CdSe水溶性量子点(quantum dots,QDs)标记ZEN单克隆抗体,并基于CdSe阳离子交换信号增强原理,建立了ZEN新型荧光免疫检测方法(CdSe QDs-FLISA),检测下限(IC₁₀)和半数抑制率(IC₅₀)分别为0.006 ng/mL和0.17 ng/mL,检测区间(IC₂₀-IC₈₀)为0.01-0.45 ng/mL。与ZEN的结构类似物(α-zearalanol、zearalanone、α-zearalenol、β-zearalenol and β-zearalanol)交叉反应性依次为22.3%、13.1%、6.2%、1.6%和3.9%,与农产品中其他真菌毒素如黄曲霉毒素B₁ (AFB₁)、赭曲霉毒素A (OTA)、呕吐毒素(DON)和伏马毒素B₁ (FB₁)几乎不存在交叉反应。该方法在玉米样本中加标回收率较高,且实际样本中ZEN的定量检测结果与LC-MS/MS一致性较好。本研究建立的CdSe QDs-FLISA操作简单,可实现对样本中ZEN的快速定量检测与分析,便于基层单位推广使用,具有较好的应用前景,同时也可为其他病原微生物检测技术的开发提供参考。     

基于纳米颗粒的赭曲霉毒素A高灵敏酶联免疫检测方法的建立及应用

赭曲霉毒素(ochratoxins)主要是由青霉菌Penicillium和曲霉菌Aspergillus产生的有毒次级代谢产物,常见于发霉或发酵的农产品中,其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)毒性最强且最为普遍。OTA是粮食作物和饲料的重要污染物,在加工、储存或运输过程中均可产生,具有肾毒性和免疫毒性,可通过蓄积作用发挥毒性效应,对人类和动物健康造成严重威胁。本研究通过将OTA单克隆抗体包被于纳米磁珠(magnetic nanoparticles,MNPs)表面,获得具有免疫活性的磁珠抗体复合物(MNPs-Anti OTA),并制备生物素标记的偶联抗原OTA-BSA-Bio,后续采用链酶亲和素标记的纳米金颗粒(Strep-HRP-AuNPs)催化底物进行信号检测,最终建立了OTA高灵敏检测方法(MNPs-bs-AuNPs-ELISA)。在最优条件下,经计算该方法检测下限(IC10)为0.01ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.02-0.73ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.13ng/mL。与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为4.3%和8.1%,对其他常见真菌毒素AFB1、ZEN、FB1、DON、CIT和PAT均无交叉反应。玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达85.6%-115.7%,对天然样本中OTA含量的检测结果表明,该方法与LC-MS/MS相关性良好。本研究建立的MNPs-bs-AuNPs-ELISA可满足谷物及饲料样本中OTA的快速、高灵敏度定量检测,成本较低,具有很好的应用前景。     

金黄色葡萄球菌A型肠毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的金黄色葡萄球菌A型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)检测方法。【方法】以原核表达的可溶性重组SEA蛋白为免疫原,获得特异性强、亲和力高的单克隆抗体作为捕获抗体,同时制备抗SEA兔多抗血清作为检测抗体建立双抗体夹心ELISA(Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法。【结果】该方法对SEA的线性检测区间为2-128μg/L(y=1.102x-0.07,R2=0.994),检测下限为1.89μg/L,与SEB、SEC2和SED之间无交叉反应;鲜奶SEA人工污染试验测定回收率为94%-114%,变异系数小于10%。应用该方法对46株金黄色葡萄球菌水产品分离株和164株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌分离株的体外培养上清进行检测,阳性率分别为4.4%和50.6%,表明SEA污染普遍存在。【结论】建立的DAS-ELISA方法特异性、灵敏度和稳定性好,为检测SEA的食源性污染提供了有效手段。     

基于纳米磁珠和双标记抗体的玉米赤霉烯酮快速、高灵敏检测方法的建立及应用

玉米赤霉烯酮(zeralenone,ZEN)具有雌激素活性,主要污染谷物和饲料,大量聚积可导致流产和死胎,给动物和人类健康带来严重威胁。本研究通过将ZEN偶联抗原ZEN-BSA包被于纳米磁珠(magnetic nanoparticles,MNPs),制备纳米磁珠-偶联抗原复合物(MNPs-BSA-ZEN),同时使用金颗粒(Au nanoparticles,AuNPs)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)双标记的ZEN单克隆抗体,建立新型酶联免疫检测方法(MNPs-HRP-AuNPsIC-ELISA)。检测下限(IC10)达到0.03ng/mL,检测区间(IC20–IC80)为0.05–0.89ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.22ng/mL,与ZEN类似物(α-zearalanol、zearalanone、α-zearalenol、β-zearalenol和β-zearalanol)的交叉反应性依次为19.2%、11.7%、8.3%、1.2%和4.3%,与黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1、桔青霉素和展青霉毒素几乎不存在交叉反应。在玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达81.6%–113.5%,与LC-MS/MS同时对天然样本中ZEN含量的检测结果表明,两种方法相关性良好。本研究建立的MNPs-HRP-AuNPs IC-ELISA具备快速和高灵敏的双重优势,也可为其他霉菌毒素精准检测技术的开发提供参考。     

黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测技术研究

【目的】制备黄曲霉毒素B1单克隆(AFB1)抗体,建立间接竞争ELISA检测方法用于污染样品中AFB1的检测。【方法】用碳二亚胺法制备黄曲霉毒素B1的完全抗原AFB1-BSA后免疫Balb/c小鼠,经过细胞融合和克隆化筛选获得抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备抗体,通过间接ELISA方法分别测定抗体亚类和效价。经优化实验条件,建立稳定的间接竞争ELISA检测方法,并用于检测饲料样品中的黄曲霉毒素B1。【结果】获得4株稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选择3B9细胞株制备抗体,测定抗体亚类为IgG1,效价为1:204 800,与黄曲霉毒素B2、G1、G2和M1的交叉反应率分别为2.2%、33.9%、1.8%和4.1%,与赭曲霉毒素A、伏马毒素和玉米赤霉烯酮几乎不存在交叉反应。以此单抗构建了AFB1间接竞争ELISA检测方法,在AFB1浓度为1.04?25.00 μg/L范围内呈线性(R2=0.993 1),检测限为1.04 μg/L,半数抑制率(IC50)为6.03 μg/L,平均加标回收率在线性范围内可达85%?120%,变异系数均小于10%。【结论】通过饲料样品检测证实,该方法与进口ELISA试剂盒检测一致性良好,可用于实际样品中黄曲霉毒素B1的快速筛检。     

基于纳米金和辣根过氧化物酶双标记抗体的黄曲霉毒素B1高灵敏检测方法的建立及应用

黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁,AFB₁）在自然界普遍存在,可污染多种粮食作物和饲料,给动物和人类健康造成严重威胁。为建立AFB₁高灵敏度的快速检测方法,本研究通过采用纳米金颗粒（Au nanoparticles,AuNPs）和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）双标记AFB₁单克隆抗体,建立新型酶联免疫检测方法（HRP-AuNPs IC-ELISA）,检测下限（IC₁₀）为0.017ng/mL,检测区间（IC₂₀-IC₈₀）为0.026-0.376ng/mL,半数抑制率（IC₅₀）为0.099ng/mL,与黄曲霉毒素B₂、G₁、G₂ 和M₁ 的交叉反应率分别为2.7%、9.3%、2.1%和5.3%,与赭曲霉毒素A、伏马毒素B₁、桔青霉素、展青霉毒素和玉米赤霉烯酮几乎不存在交叉反应。在玉米和面粉样本中的加标回收率可达88.93-103.55%,与LC-MS/MS同时对天然样本中AFB₁ 含量进行检测,结果表明,两种方法相关性良好。本研究建立的HRP-AuNPs IC-ELISA耗时短且灵敏度高,可用于实际样本中AFB₁ 的快速定量检测与分析,也为其他霉菌毒素的精准检测技术开发提供参考。     

基于量子点标记的赭曲霉毒素A快速、高灵敏荧光免疫层析检测方法的建立及应用

赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）具有肾毒性、致畸性、致癌性和免疫毒性,广泛存在于各种粮食作物及其副产品中,是食品和饲料原料的重要污染物,可在人类及动物体内蓄积,在已知发现的真菌毒素中,重要性和危害性仅次于黄曲霉毒素。本研究通过采用量子点荧光微球（quantum dots,QDs）标记OTA单克隆抗体,并基于免疫层析原理,优化、建立了OTA高灵敏荧光免疫层析检测方法（FICGA）,15min即可实现对农产品中OTA污染的快速定量检测。该方法检测下限（IC₁₀）达到0.04ng/mL,检测区间（IC₂₀-IC₈₀）为0.05-0.59ng/mL,半数抑制率（IC₅₀）为0.18ng/mL。与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为7.3%和11.9%,对其他常见真菌毒素AFB₁、ZEN、FB₁和DON均无交叉反应。在玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达83.2%-117.8%,与LC-MS/MS同时对天然样本中OTA含量的检测结果表明,两种方法相关性良好。本研究建立的FICGA快速、灵敏,可满足基层单位和现场的快速检测需求,具有很好的应用前景。