抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体——Ⅰ.杂交瘤细胞株的获得

用炭疽保护性抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合,融合剂为PEG1000。用放射免疫方法筛选分泌特异抗体的杂交瘤细胞后,经有限稀释法及再克隆选择单克隆细胞,获4株能产生抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经染色体组型分析,证明是杂交细胞。体外连续培养8个月,仍能持续稳定地分泌抗体。其中,C17杂交细胞株,从它冰冻保存的第20代细胞复苏后,又传30多代,并接种在小鼠腹腔内增殖,仍能分泌特异性抗体。用正向间接血凝法测定其培养上清液及腹水,抗体滴度分别为1:256～512,1:4,096～6,144。     

炭疽杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用基因重组技术获取炭疽杆菌保护性抗原(PA)。将炭疽杆菌保护性抗原编码基因pag与pET载体连接构建重组质粒,转化大肠杆菌DE3株,诱导表达炭疽杆菌保护性抗原,并经亲和层析及凝胶过滤纯化此抗原。实验成功构建了表达炭疽杆菌保护性抗原的重组菌株,纯化后PA纯度达90%,且经检测纯化产物具有天然PA的生物学活性。同时表明从大肠杆菌中纯化PA较以往从炭疽杆菌中获取PA简便易行。     

炭疽毒素保护性抗原第四结构域在大肠杆菌中的可溶性表达

人工优化设计并合成炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并与噬菌体gⅢ蛋白N端结构域基因融合,在大肠杆菌中可溶性表达融合蛋白。结果表明合成了炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并在大肠杆菌中获得了高效可溶性融合表达,可溶性表达产物占细菌总蛋白量的36％左右;经亲和层析纯化获得了重组蛋白;Western印迹分析表明,表达产物能与His单抗（重组蛋白羧基端带有6xHis）发生特异性结合反应。以上结果表明获得了炭疽毒素保护性抗原第四结构域,为利用人抗体库进行筛选抗炭疽毒素的人源性中和抗体奠定了基础。     

抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体——Ⅱ.抗体的鉴定

单克隆C17细胞所分泌的抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体,用固相放射免疫、放射性双扩散及硝酸纤维膜印迹实验,鉴定为阳性,能与此抗原特异地结合。经Protein A-SepharoseCL-4B分离提纯此抗体,再用兔抗鼠标准血清鉴定,其亚型为IgM。将此单克隆抗体偶联到Sepharose 4B上,将炭疽抗原过柱,然后把洗脱液进行电泳分析,证明C17分泌的抗体特异地针对炭疽保护性抗原中分子量为19,000道尔顿的组分。     

炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达及其多克隆抗体的制备

原核表达炭疽杆菌保护性抗原受体结合区并制备该蛋白的多克隆抗体.从炭疽芽胞杆菌A16R中经PCR扩增得到了炭疽菌保护性抗原(PA)受体结合区基因,即PA的第四结构域(PA-D4),将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-2b(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrapTM Chelating HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western blot检测抗血清.结果表明,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对PA-D4融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1∶ 102 400;其抗体能特异性识别内源性的PA.PA-D4重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能和炭疽疫苗免疫保护机制奠定了基础.     

炭疽活疫苗家兔免疫力与血清抗芽胞IgG关系的研究

炭疽疫苗是预防炭疽流行和炭疽生物恐怖的重要手段。已有动物实验表明,炭疽活疫苗的保护力优于以保护性抗原为主要成份的无细胞疫苗,但两类现行疫苗都有待重新评价和改进。炭疽疫苗的效力必须用适当的实验室方法进行检测与分析才能了解其性质和细节。试验中力图探寻炭疽活疫苗家兔免疫力与血清抗芽胞抗体水平的关系。用“皮上划痕人用炭疽活疫苗”免疫家兔,以特定制备的炭疽芽胞抗原用ELISA法检测血清抗炭疽芽胞IgG抗体水平,并用强毒炭疽杆菌攻击进行效力试验。免疫家兔血清几何平均抗芽胞IgG滴度在免疫后一个月内持续升高,14d达到206,28d时达到776,这时其抵抗20MLD毒菌攻击的保护率为80％,符合中国生物制品规程要求的保护力。一个月后抗体水平开始下降,42d时滴度降至223。实验所揭示的炭疽减毒活疫苗诱导的家兔抗芽胞IgG抗体与抗炭疽保护力之间的关系,既为评价现行疫苗提供了资料,也为研制新型疫苗建立了参考性指标。     

炭疽芽胞杆菌疫苗研究进展

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病死亡率非常高 ,当前的疫苗具有效力不稳定、对吸入性炭疽的保护率低、免疫程序繁琐、存在副作用等缺点。近年来人们在改造传统疫苗的同时又有一些新的发现 ,如保护性抗原 (PA)的抗体在体内可杀死芽胞 ;通过粘膜免疫能够诱导机体分泌IgA抗体 ;抗多聚谷氨酸 (γ D PGA)抗体可以同炭疽杆菌的繁殖体作用 ,从而杀死繁殖体 ;寻找到新的免疫原。DNA疫苗、活载体疫苗的出现为新一代安全、免疫程序简单、具更高保护率的疫苗奠定了基础     

针对炭疽保护性抗原不同结构域的中和性单克隆抗体的筛选和鉴定

炭疽保护性抗原（PA）是炭疽毒素的重要组分,同时也是现有炭疽疫苗的主要有效成分,在炭疽杆菌的致病与免疫中发挥关键作用。以重组PA为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,结合炭疽毒素敏感细胞的毒性中和试验,大量筛选抗PA单克隆抗体,获得了9株炭疽毒素中和性单抗。进一步分析表明这些单抗以IgG1亚类为主,分别识别PA 3个结构域的4个不同中和表位区。针对结构域2的4株单抗识别同一表位区,其中3株单抗的中和活性强于抗PA多抗;针对结构域4的4株单抗识别两个不同表位区;另有1株单抗识别位于结构域3的表位。实验结果提示PA具有多个中和表位,分别位于其不同结构域,其中结构域2、4包含主要中和表位。实验中获得的针对不同表位的中和性单抗为深入研究PA的免疫保护机理提供了工具,也为研制针对炭疽毒素的被动免疫制剂和治疗药物打下基础。     

用马匹制备炭疽沉淀素诊断血清的试验小结

本文报告了用炭疽死菌抗原免疫马匹制备炭疽沉淀素血清的试验情况:证明静脉注射水剂抗原和皮下或肌肉注射油剂抗原,在超免疫达第四针免疫时(即自免疫开始第27天后)就可获得在3—5分钟出现环状沉淀反应的诊断血清。     

重组炭疽保护性抗原的表达、纯化与生物活性分析

构建分泌型表达质粒 ,在大肠杆菌中实现了重组炭疽保护性抗原 (rPA)的分泌型表达。重组蛋白位于细菌外周质 ,表达量约占菌体总蛋白的 10 %。以离子交换、疏水层析和凝胶过滤为基础 ,建立了rPA的纯化工艺 ,每升培养物可获得约 15mgrPA ,纯度可达 95 %以上。体外细胞毒性试验显示rPA具有较好的生物学活性。用rPA免疫家兔产生的抗血清在体外可抑制炭疽致死毒素的活性 ,表明rPA可诱导机体产生保护性免疫。以上结果为今后发展新一代炭疽疫苗打下基础     

炭疽杆菌的致病因子与炭疽的防治

炭疽为一种人、兽共患急性传染病,部分国家将炭疽杆菌作为生物威胁因子进行研究和生产。该菌毒性与质粒PXOl、PXO2有关,PXOl产物包括水肿因子、保护性抗原和致死因子。PXO2是另一编码致病因子,产物荚膜抑制细胞的吞噬,有助病菌繁殖、扩散和建立感染。抗生素与抗炭疽血清联合应用,突变保护性抗原、水肿因子、致死因子联合注射,Al(OH)3佐剂PA疫苗,减毒口服菌苗,PA基因重组活菌苗均可抵抗炭疽杆菌致死性攻击。     

制造化学菌苗的方法学

<正>化学菌苗是用病原微生物的保护性抗原制备的免疫制品。保护性抗原是诱导对抗病原菌某种致病作用的特异性抗体的抗原物质。保护性抗原通常具有聚合物性质,在机能上是病原菌的致病性因子,宿主在进化中产生对此类因子的特异性免疫应答力。应强调指出并非所有的致病性因子都能视为保护性抗原,虽然后者必定是一种致病性因子。用保护性抗原制造菌苗是在特异性预防传染病方面最合理和有前途的趋向之一。与颗粒化学菌苗不同,化学菌苗不含杂质,并且容易检定和控制。     

四联活菌苗气雾免疫研究——Ⅲ.炭疽、布氏、鼠疫、土拉活菌苗联合气雾免疫家兔血清抗体测定及炭疽菌苗的保护力试验

一、炭疽活菌苗单价气雾或与布氏、鼠疫、土拉联合气雾一次吸入免疫均能产生较好的免疫力,每只动物剂量3亿,攻击80个绝对致死量可保护70-100%。二、应用炭疽乳胶抗原测定免疫血清抗体水平,可见动物保护在70-100%时,其血清几何平均滴度为1：12-1：18之间。在四联气雾免疫中,不论是血清抗体的产生还是对强毒菌的攻击,都与单价结果相近,看不出有干扰现象。三、应用炭疽、鼠疫乳胶抗原,布氏、土拉菌体染色抗原测定血清抗体,结果表明上述四种菌苗免疫后六天半数以上动物产生抗体,十二天内可达100%阳转。四、用炭疽、鼠疫乳胶抗原在免疫前测定动物自然抗体,全部为阴性,免疫后血清滴度达到1：5者,玻片全血凝集即为阳性。玻政策全血凝集具有特民、敏感、简易、快速等特点,可作为炭疽、鼠疫活菌苗免疫后效果观察的辅助方法。     

重组PA4复制子病毒颗粒疫苗免疫原性的分析

目的:构建携带炭疽毒素保护性抗原第四结构域(PA4)基因的重组Semliki森林病毒(SFV)复制子病毒颗粒,并对其免疫原性进行研究。方法:将编码炭疽PA4的SFV复制子DNA载体pSCAR-SPA4,与辅助SFV DNA载体pSHCAR共转染BHK21细胞,制备表达PA4的重组复制子病毒颗粒;用重组复制子病毒颗粒疫苗免疫小鼠,并采用ELISA法检测其血清抗体水平和细胞因子IFN-γ和IL-4。结果:免疫小鼠血清中检测到较高的抗体水平,免疫小鼠的脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后产生了明显的T细胞增殖反应并分泌产生了IFN-γ和IL-4。结论:重组PA4复制子病毒颗粒疫苗免疫小鼠后能够产生特异性的抗体反应和细胞免疫反应。制备的重组PA4复制子病毒颗粒极有潜力作为人用炭疽候选疫苗,为进一步研究新型炭疽疫苗奠定了基础。     

利用组氨酸合成酶基因作为同源双交换序列构建在乳酸乳球菌中表达炭疽杆菌保护性抗原的载体

目的:为了实现炭疽杆菌保护性抗原(PA)在乳酸乳球菌中的整合性表达,利用组氨酸合成酶基因(HISB)作为同源交换序列构建表达PA的载体。方法:采用PCR等方法将酸启动子P170、红霉素抗性基因、HISB及酶切位点克隆到pMD18-T载体上,命名为pHEC-P170-PA。结果:构建好的双交换载体经酶切电泳鉴定并测序,其序列中含有PA基因。结论:构建了炭疽杆菌保护性抗原基因同源双交换载体。     

微波处理修复抗原后免疫组织化学方法效果的比较研究

冰冻切片经微波处理进行抗原修复后,免疫组织化学方法的敏感性明显提高,显色效果明显增强。提出了冰冻切片在免疫组织化学显色前进行抗原修复的必要性     

利用转基因小鼠筛选全人源炭疽致死因子中和抗体

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的严重威胁人类健康的传染病。炭疽毒素包括3种蛋白质成分:保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。PA与LF形成致死毒素(LT),与EF形成水肿毒素(ET)。由于致死毒素(LT)在感染者损伤及死亡中发挥主要作用,因此在炭疽感染晚期单纯使用抗生素治疗难以发挥疗效,治疗性中和抗体成为目前最有效的炭疽治疗药物。目前国外获得的炭疽毒素抗体多为炭疽PA抗体,美国FDA已批准瑞西巴库(人源PA单抗)用于吸入性炭疽的治疗。一旦炭疽芽孢杆菌被人为改构或PA中和表位发生突变,针对PA单一表位的抗体将可能失效,因此针对LF的抗体将成为炭疽治疗的有效补充。目前国外已有的LF抗体多为鼠源抗体和嵌合抗体,而全人源抗体可以避免鼠源抗体免疫原性高等缺点。本研究首先用LF抗原免疫人抗体转基因小鼠,利用流式细胞仪从小鼠脾淋巴细胞中分选抗原特异的记忆B细胞,通过单细胞PCR方法快速获得两株具有结合活性的抗LF单抗1D7和2B9。瞬时转染Expi 293F细胞制备抗体,通过毒素中和实验(TNA)发现1D7和2B9在细胞模型中均显示较好的中和活性,并且与PA单抗联合使用时,表现出较好的协同作用。总之,本文利用转基因小鼠、流式分选技术和单细胞PCR技术的优势,快速筛选到全人源LF抗体,为快速筛选全人源单克隆抗体开辟了新的思路与方法。     

炭疽毒素及其细胞受体的研究进展

炭疽毒素由 3种蛋白组成 :保护性抗原 (protectiveantigen ,PA)、致死因子 (lethalfactor,LF)和水肿因子 (edemafactor ,EF) .综述炭疽毒素研究的最新进展 .主要介绍炭疽毒素的关键致病因子———LF的结构与功能 ,炭疽毒素膜转运成分PA的结构及其受体 (anthraxtoxinreceptor ,ATR)和其cDNA克隆的结构 ,并讨论了在炭疽的治疗、预防和毒素在肿瘤治疗中的可能应用 .     

PA domain4-Fc融合蛋白抗血清可以保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素损害

目的:探讨炭疽杆菌保护性抗原PA(protective antigen)domain4能否作为炭疽疫苗和炭疽感染时紧急预防用药.方法:构建含有PA domain4和人IgG Fc片段的表达载体,通过免疫大耳白兔获得针对该融合蛋白的免疫血清,通过小鼠巨噬细胞保护试验验证PA domain4-Fc是否具有疫苗和紧急预防用功能.结果:获得了表达PA domain4-Fc融合蛋白的CHO细胞株和针对PA domain4-Fc的兔抗血清,细胞保护试验证实PA domain4-Fc抗血清能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素的攻击,但PA domain4-Fc蛋白本身并不能直接拮抗炭疽毒素对细胞的损害.结论:PA domain4-Fc抗血清可以保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素损害,表明PA domain4-Fe具有作为炭疽疫苗的可能,但PA domain4-Fc蛋白不能直接竞争性拮抗炭疽毒素损害细胞.     

重组炭疽水肿因子的表达与生物活性分析

炭疽毒素包括3种蛋白因子,即保护性抗原（PA）、致死因子（LF）和水肿因子（EF）。EF是钙调蛋白依耐的腺苷酸环化酶,可使细胞cAMP浓度升高,导致宿主防御能力下降。为深入研究炭疽毒素的作用机理,构建了原核表达质粒,在大肠杆菌中表达出重组EF（rEF）。经鉴定,rEF以可溶形式表达于细菌胞质中。经过金属螯和层析、阳离子交换层析和凝胶层析,每升诱导培养物可获得约5mg 重组蛋白。用重组蛋白免疫家兔获得了兔多抗,能够在细胞试验中中和rEF,体外细胞试验显示rEF具有很好的生物活性,在J774A.1和CHO细胞试验中,能与LF共同竞争和PA的结合位点,相互抑制。上述工作为深入研究炭疽毒素的作用机理,开发针对EF的毒素抑制剂打下基础