鲎C因子的性质、结构、功能及应用

鲎C因子是一种分子量为123kD的丝氨酸蛋白酶原,主要由六种结构域构成,能特异地结合内毒素分子而被激活。在内毒素的检测,抗内毒素治疗,去除生物制品中污染的内毒素,以及在抗微生物作用中有多种潜在的应用价值 。     

炭疽受体CMG2-Fc 融合蛋白在CHO 细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:构建炭疽受体CMG2和人IgG1 Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素(PA+LF)的能力。方法:将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgG1的Fc片段基因共同连接入pcDNA3.1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264.7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果:获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论:CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。     

一株斑点热立克次体的病原学研究

自内蒙古自治区的草原革蜱（D．Nuttalli）中分离到一株斑点热立克次体。用微量酶标染色方法进行血清学鉴定表明,系西伯利亚（Rickettsiaesibirica种血清型。G＋Cmol％含量为32.4％。对其核酸进行聚合酶链扩增／限制性核酸内切酶消化（PCR／RFLP）分析DNA长度多态性,分别引用立氏立克次体蛋白抗原基因Rr190序列作为扩增引物Rr190．70p～602n和Rr190．4442p～5664n,扩增后分别用Pst1和Rsal限制性核酸内切酶消化。其电泳图谱证     

用高效液相色谱测定重组人尿激酶原制剂的蛋白含量

目的:用RP-HPLC方法对注射用重组人尿激酶原制剂蛋白含量进行定量分析。方法:用反相C18柱、0.1%TFA水溶液与0.1%乙腈进行梯度洗脱,280nm波长紫外检测器监测;以重组人尿激酶原同质标准品作为对照品,根据进样量和相应的峰面积建立标准曲线方程,将待测定样品的峰面积代入标准曲线方程,可测得蛋白含量。结果:按照方法学验证要求对此方法进行了专属性、检测限、定量限、线形、精密度(重复性、中间精密度)、准确度(回收率)考察,线性范围为9～27μg,回收率在97%以上,RSD2.0%,完全满足对制剂蛋白的定量需求。结论:本方法准确,适用于注射用重组人尿激酶原成品制剂蛋白定量测定。     

免疫亲和层析法纯化单链尿激酶型纤溶酶原激活剂

尿激酶原 (Ｐｒｏ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ,ｐｒｏ ＵＫ) ,也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｓｃｕ ＰＡ) ,与ｔ ＰＡ一样是第二代溶栓药物。给药时 ,保持无活性的酶原状态 ,只激活被纤维蛋白吸附的纤溶酶原 ,而对游离的纤溶酶原没有作用 ,即只在血栓表面才能活化转变为双链尿激酶 (Ｔｗｏ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔｃｕ ＰＡ或ＵＫ) ,因而具有较高的特异性溶血栓作用[1 ] 。尿激酶原…     

用悬浮搅拌培养体系体外大量扩增人脐血造血干/祖细胞

目的 :建立一种简便、有效的脐血造血干 /祖细胞体外大量扩增培养体系。方法 :淋巴细胞分离液分离的脐血单个核细胞在SCF ,IL - 3,IL - 6三种细胞因子的作用下 ,于悬浮搅拌培养体系中培养 ,分析其总细胞数、CFU -GM、CD34+ 细胞的扩增倍数。结果 :脐血单个核细胞在悬浮搅拌培养体系中培养 12天后 ,其总细胞数、CFU -GM、CD34+ 细胞的扩增倍数分别为 6 .31± 1.5 2 ,2 0 .6 3± 1.5 4和 7.11± 1.12。结论 :悬浮搅拌培养体系是脐血造血干 /祖细胞体外大量扩增的有效培养体系。     

在鸡胚绒毛尿囊膜上评价血管生成技术的应用与优化

目的：用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）评价血管生成并进行优化,为抗血管生成药物筛选提供良好的体内实验模型。方法：对CAM技术的各个环节,包括合适日龄胚蛋选择、蛋壳开窗及暴露CAM的方法、载体选择、结果分析等进行了实验对比。结果：采取气室开窗,以甲基纤维素为药物载体,促进血管生成的药物在孵化11d以后、抑制血管生成的药物在孵化7～9d给药,鸡胚存活率为85.8%,生长状况良好,被检测药物有明显的抑制或促进血管生成的效应。结论：通过优化建立了操作简便、鸡胚存活率高的在CAM上评价血管生成的技术;应用CAM技术评价了若干影响血管生成的因子。     

重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂的冻干及活性贮存时间估计

研究重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂 ( u- PA)的冻干工艺 ,并对冻干产品的稳定性进行了观察。产品放置在 - 70℃和 4℃一年 ,活性和纯度未见明显变化。同时 ,通过在 80℃、70℃和 60℃的加速贮存试验 ( MIS) ,观察了 u- PA冻干产品的热稳定性 ,并对其活性的热降解速度和贮存寿命进行了估算。结果在 37℃、2 5℃、4℃和 0℃贮存时 ,活性单位损失 5 0 %所需时间分别为 1 73天、2 .78年、70 .8年和 1 1 8年 ;活性损失 1 0 %所需时间分别为 2 0天、1 0 0天、7.6年和 1 1年。说明 u- PA经冷冻干燥后保存 ,活性和纯度是稳定的     

多孔微载体无血清培养rCHO细胞生产u-PA

在30L搅拌式反应器中无血清培养分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)的DNA重组CHO细胞,定期部分更换Cytopore多孔微载体,使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖,解决大规模细胞培养中的细胞凋亡问题。在91d连接换液培养过程中,细胞密度可维持在(1.3～2.6)×107/mL,活细胞比率维持在90%以上。在7.5L搅拌罐中培养细胞,利用外部周期性压力振荡刺激并结合载体更新技术,可减轻密度效应对细胞生长和表达的影响,在一定程度上提高细胞在高密度培养条件下的表达水平。在67d连续换液培养中,细胞最高密度为2.64×10⁷/mL,活细胞比率维持在95%以上。与稳压操作相比,利用周期变压刺激技术可提高产量10%～20%,且可降低葡萄糖厌氧代谢生成乳酸的转化率,利用4步纯化工艺,从含u-PA约135g的2100 L上清中获得约80guPA(单链比例约为90%)。     

重组人尿激酶原纯化中浓缩方法的比较

对尿激酶原纯化中的浓缩方法进行了探索,先后采用了3种不同的方法,即超滤、CM-阳离子柱、疏水色谱柱浓缩。结果表明,超滤只适合于大量样品的浓缩,样品量较小时损失较大,而且机械作用较强会使部分产品分解;CM-阳离子枉浓缩回收率较高,但得到的产品盐浓度高,还需要经过脱盐处理,增加了操作步骤,而疏水柱浓缩方法较为理想,经它浓缩后的产品用SDS-PAGE分析,非还原条件下,纯度在98％以上,还原条件下单链占90％以上,浓缩16倍,尿激酶原浓度达到3mg/ml以上。