雌激素受体β真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体（ER）β的哺乳动物细胞表达载体,并检测其转录活性。方法：利用PCR扩增带有Flag标签的人类ERβ全长编码序列,将扩增片段克隆到哺乳动物细胞表达载体pIRESpuro2中,得到重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERβ;用Western blot鉴定Flag-ERβ重组蛋白在人胚肾293T细胞中的表达;用含雌激素应答元件（ERE）的报告基因系统检测Flag-ERβ的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERβ重组质粒,其介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含ERE的报告基因的表达。结论：ERβ高效真核表达载体的构建,为进一步研究ERβ在乳腺癌等疾病中的功能奠定了基础。     

雌激素受体与Ⅰ型胶原蛋白存在相互作用

目的:利用酵母双杂交技术筛选与雌激素受体(ER)αAF1转录激活结构域相互作用的蛋白,为乳腺癌发生、发展机制的研究奠定基础。方法:将编码ERαAF1的cDNA片段克隆到诱饵蛋白载体pGBKT7中,以构建的pGBKT7-ERα-AF1为表达靶蛋白的质粒,筛选人乳腺文库。将筛选到的含Ⅰ型胶原基因的质粒与表达ERα和ERβ不同结构域的质粒共转化酵母细胞,验证Ⅰ型胶原与ERαAF1作用的特异性。结果:经酶切鉴定,证实重组质粒pGBKT7-ERα-AF1含有目的基因片段;Western印迹证实ERαAF1在酵母中获得表达;酵母双杂交筛选得到与ERαAF1相互作用的Ⅰ型胶原蛋白。酵母细胞共转化实验证实,Ⅰ型胶原蛋白与ERα和ERβ的AF1结合,但与ERβ的DBD、AF2不结合。结论:Ⅰ型胶原与ERα和ERβ的AF1及ERβ的DBD存在相互作用。     

乳腺癌雌激素受体β不同亚型表达载体的构建及其转录活性分析

目的：构建人乳腺癌中雌激素受体B（ERβ）3种亚型ERβ1、ERβ2和ERβ5的真核表达载体,测定不同亚型ERβ的转录活性。方法：以乳腺癌细胞MCF7的cDNA为模板,PCR扩增ERβ1、ERβ2和ERβ5万基因,分别克隆到pXJ40-Mye载体,Western印迹检测克隆载体在293T细胞内的表达;将上述载体与含雌激素应答元件（ERE）的萤光素酶（Luc）报告基因载体（ERE—luc）共转293T细胞,测定各亚型ER／3的转录活性。结果：构建了Myc—ERβ1、Myc—ERβ2和Mye—ERβ5表达载体,转录活性结果显示上述表达载体均具有活性,雌激素可升高ERβ5的转录活性,不能升高Eβ2和ER5的转录活性。结论：该研究为进-步探讨不同亚型ERβ在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

雌激素受体α真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体α（ERα）高效真核表达载体,并检测其转录活性。方法：用常规PCR方法特异扩增带有Flag标签的人ERα全长编码序列,经双酶切后将其克隆到真核表达载体pIRESpuro2中,构建重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERα;用Westernblot鉴定该重组质粒介导的Flag-ERα在人胚肾细胞株293T中的表达情况;用含雌激素应答元件的报告基因系统检测ERα的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERα重组质粒,该质粒介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含雌激素应答元件的报告基因的活性。结论：ERα高效真核表达载体的构建为进一步研究ERα在乳腺癌中的作用奠定了基础。     

PES1与雌激素受体存在相互作用

雌激素(E2)和雌激素受体(ER)在E2诱发的肿瘤中起着极其重要的作用.ER共调节因子通过与ER相互作用调节其生物学功能.PES1主要表达于E2的重要靶器官如乳腺、卵巢等组织中,并在乳腺癌细胞中高表达.用PCR技术构建HA标签的PES1全长以及1～322aa、312 ～588aa和414～588aa三个不同功能区片段的重组质粒.将不同的重组质粒与FLAG-ERα和或FLAGC-ERβ共转染293T细胞后进行免疫共沉淀,以验证PES1与ER是否有相互作用以及相互作用的区域.用含雌激素受体作用元件的荧光素酶报告基因( ERE-LUC)检测PES1对ERα和ERβ转录激活活性的影响.结果表明,PES1与ERα和ERβ均相互作用,且PES1的1～ 322aa区域与ERα和ERβ相结合.PES1能特异地、E2非依赖性抑制ERβ的转录激活活性.实验结果显示,PES1是一个新的ER共调节因子,需要进一步研究其在ERβ信号通路及其在E2诱发的肿瘤的作用.     

Smads转录激活检测系统的建立

目的:构建Smads转录激活检测系统,以研究Smad2、Smad3、Smad4的功能。方法:将Smad2/3/4编码序列以正确读码框与pRC-lac载体中的Lac阻遏蛋白编码序列融合构建重组质粒,将重组质粒与受Lac操纵子调控的荧光素酶报告基因质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,其活性的强弱即代表转录活性的强弱。结果:Smad2和Smad3具有较强的依赖于TGF-β1的转录活性;Smad4全长没有检测到转录活性,但其SAD结构域有不依赖于TGF-β1的转录活性,MH2结构域有依赖于TGF-β1的转录活性。结论:构建的Smads转录激活检测系统能有效地用于Smad2、Smad3、Smad4功能的研究。     

雌激素受体β表达载体的构建及其转录活性测定

为探索雌激素受体B(ERβ)在乳腺癌形成过程中的分子机制,构建出带HA标签的ERl3真核表达载体。首先将PCR扩增出的带HA标签的DNA片段连接到pcDNA3载体中,得到重组质粒pcDNA3-HA。再将ERβ完整编码区序列克隆到pcDNA3-HA中,得到重组质粒pcDNA3-HA—ERβ。Western印迹结果表明,转染pcDNA3-HA-ERβ重组质粒的293T细胞表达了与预期大小一致的HA—ERβ。用含雌激素应答元件的报告基因系统检测ERβ的转录活性表明。HA—ERβ在293T细胞中的表达激活了报告基因的表达。ERβ表达载体的成功构建为深入研究其生物学功能打下了坚实的基础。     

雌激素受体β潜在磷酸化位点突变体的构建及其活性测定

目的：构建雌激素受体（ER）β潜在磷酸化位点突变体,并在人胚肾细胞293T中检测其对ERβ下游基因转录的影响。方法：通过ERα和ERβ序列同源性比对,寻找ERβ的潜在磷酸化位点;以pcDNA3-ERβ-FLAG为模板,通过重组PCR,将ERβ264位、469位Ser编码基因突变为Ala编码基因,将突变片段连接到同样双酶切的pcDNA3-FLAG载体中,Western blot检测其表达;将重组质粒转入293T细胞中,检测突变体对含雌激素应答元件（ERE）的报告基因转录活性的影响。结果：ERα和ERβ序列同源性比对发现ERβ的264位Ser和469位Ser可能是其潜在的磷酸化位点;构建了ERβ264位和469位2个点突变体载体pcDNA3-FLAG-ERβ（S264A）和pcDNA3-FLAG-ERβ（S469A）,Western blot可检测到ERβ突变体融合蛋白在293T细胞中表达。萤光素酶活性检测表明,在没有雌激素刺激的情况下,2个突变体的活性较野生型没有变化;加入雌激素后,突变体的活性较野生型略有升高。结论：ERβ的264位和469位Ser位点的磷酸化可能不是ERβ调节下游基因转录所必需的,活性升高可能是由于ERβ构象变化造成的。     

FHL2转录激活结构域的定位

LIM蛋白家族成员FHL2 (fourandhalfLIMdomainprotein)在转录调节、细胞凋亡及肿瘤的发生发展中都起着重要作用。利用GAL4转录因子中的DNA结合结构域 (DBD)和含有与DBD结合序列的荧光素酶报告基因(GAL4 LUC)构建了哺乳动物细胞转录激活系统 ,并利用该系统定位了FHL2的转录激活结构域。首先将GAL4 DBD序列以正确读框插入到pcDNA3载体的多克隆位点中 ,构建成真核表达载体pDBD ,再将野生型FHL2及其不同片段以正确读框与pDBD中GAL4 DBD序列融合 ,构建成野生型FHL2及其缺失突变体表达载体。将这些表达载体分别瞬时转染 2 93T胚胎肾细胞 ,野生型FHL2及其缺失突变体都得到了表达。利用GAL4 荧光素酶报告基因对野生型FHL2及其不同突变体的转录激活活性检测表明 ,在 2 93T胚胎肾细胞和乳腺癌MCF 7细胞中 ,野生型FHL2具有转录激活活性 ,缺失N端半个LIM结构域使FHL2转录激活活性降低 ,缺失C末端第二个LIM结构域对FHL2的转录激活功能影响不大 ,缺失C末端最后一个LIM结构域则使FHL2的转录激活功能完全丧失 ,而C末端缺失 2个LIM结构域使FHL2转录激活活性又有所恢复。这说明FHL2C末端最后一个LIM结构域对其转录激活功能是必需的 ,而C末端第二个LIM结构域可能对FHL2的转录激活功能有负调控作用 ,这种负调控作用取决于     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

ERβ相互作用蛋白PSMC5的分离及其在ERβ信号途径中的作用

雌激素受体β（ERβ）在乳腺癌发生发展中起着重要的作用,寻找与ERβ相互作用的共调节因子对阐明ER信号通路具有重要价值.应用酵母双杂交技术,以ERβ的AF2结构域为诱饵蛋白从人乳腺文库中筛选出了与之相互作用的蛋白26S蛋白酶的亚单位ATPase 5（PSMC5）.GST沉淀实验表明,PSMC5在体外特异地与ERβ相结合.转录活性实验表明,PSMC5以激素依赖的方式降低ERβ转录活性.上述结果提示,PSMC5可能通过影响ERβ信号途径在乳腺癌发生发展中起着重要的作用.     

乙型肝炎病毒蛋白对纤维介素基因的激活作用

纤维介素基因（fgl2）在人和小鼠的重型肝炎的发病机制中发挥重要作用.为探讨乙型肝炎病毒（HBV）编码蛋白对人纤维介素基因（hfgl2）的激活作用, 构建了HBV编码蛋白C、 S和X的真核表达质粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx, 分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因质粒（βGal ）共转染到CHO细胞和HepG2 细胞, 采用免疫组织化学和免疫印记方法(Western blotting)鉴定病毒蛋白的表达.通过检测报告基因荧光素酶（LUC）及β半乳糖苷酶的表达活性, 反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用.结果显示, 转染了真核表达质粒的细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白, 在CHO细胞, 转染pcDNA-HB组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的5.4和6倍, 在hepG2细胞, 转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的8.7和11倍.研究表明, CHO和HepG2细胞中表达的HBV C蛋白和X蛋白均具有激活hfgl2的功能, 而S蛋白则不能激活.进一步揭示了HBV病毒蛋白与宿主基因的相互作用机制.     

CUEDC2与雌激素受体β相互作用并抑制其转录活性

目的：探索未知功能蛋白CUEDC2对雌激素受体（ER）β转录活性的调控,为进一步阐明CUEDC2在乳腺癌发生发展中的作用提供线索。方法：运用双荧光报告系统检测雌激素受体的转录激活活性,运用GST pull-down技术检测CUEDC2与ERβ的相互作用,同时外源过表达CUEDC2及ERβ,通过Western印迹检测CUEDC2对ERβ表达水平的影响。结果与结论：CUEDC2能够与ERβ相互作用并抑制ERβ的转录活性,但其对ERβ的表达水平没有影响。     

雌激素受体α磷酸化位点突变体T224A和S559A的构建及其转录激活活性检测

目的:构建雌激素受体α(ERα)T224A和S559A磷酸化位点突变体载体,在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变。方法:以pc DNA3-Flag-ERα为模板,通过重组PCR技术扩增目的基因片段并突变碱基,插入pc DNA3-Flag载体;将构建的质粒转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western印迹检测融合蛋白的表达,采用萤光素酶报告基因方法检测ERα突变体的活性改变。结果:T224A和S559A磷酸化位点突变体在HEK293T细胞中得到表达,相对分子质量为66×103。在无雌激素(E2)时,野生型ERα及T224A和S559A突变体的转录活性分别为空载体的1.94、1.49和1.84倍;在雌激素存在时,野生型ERα活性增强了1.57倍,T224A和S559A突变体活性分别增强了0.54和0.61倍。结论:224位Thr磷酸化修饰对ERα的活性起重要作用,且2个磷酸化位点突变体受雌激素调控减弱。     

利用Gal4/ VP16- UAS 和双荧光素酶报告基因 系统检测??- 分泌酶活性

目的：确立基于Gal4／vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶切割淀粉样前体蛋白活性的方法。方法：将插入上游激活序列（SAS）和萤火虫荧光素酶报告基因的质粒MH100,嵌舍酵母活性转录因子（Gal4）、单纯疱疹病毒蛋白（VP16）和γ-分泌酶切割位点的质粒C99-GVP,以度海肾荧光素酶质粒pRL—CMV,用脂质体转染法转入稳定表达淀粉样前体蛋白C末端的人神经母细胞瘤细胞（SH—SYSY）,用免疫沉淀Western blot分析法检测β-淀粉样蛋白（邶）的生成,利用Gal4／vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶报告基因的表达。结果：免疫沉淀Westem blot分析表明A（的生成在γ-分泌酶激活荆神经节苷脂GM1作用下升高并呈剂量依赖性,同时双荧光素酶法检测γ-分泌酶活性也同步升高。在γ-分泌酶抑制荆作用下Aβ的产生呈荆量依赖性的减少,同时γ-分泌酶活性也同步降低。结论：基于Gal4／vp16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性的方法有效可靠,是一种敏感、定量的检测方法。     

癌基因MDM2对雌激素受体转录活性的调节作用

目的:检测MDM2基因对雌激素受体α和β(ERα和ERβ)是否具有转录活性调节作用。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增MDM2序列,并将其以正确相位与pcDNA3-FLAG载体中的FLAG序列融合,构建成重组质粒pcDNA3-FLAG-MDM2;以含雌激素反应元件的荧光素酶(ERE-LUC)为报告基因,通过检测荧光素酶活性来确定MDM2是否对ER有转录调节因子的作用。结果:克隆和表达了MDM2基因;MDM2只对ERα具有转录活性调节作用。结论:MDM2对ER转录活性的调节具有亚型特异性。     

与雌激素受体β相互作用的蛋白的分离及鉴定

目的:从乳腺文库中分离与雌激素受体β(ERβ)相互作用的蛋白质。方法:将ERβ基因克隆入酵母表达载体pGBKT7中,利用酵母双杂交筛选技术,从乳腺文库中分离与ERβ相互作用的蛋白质。结果:分离到与ERβ相互作用的蛋白质FBLN1,并进一步确定了ERβ与FBLN1作用的结构域为AF1及DBD结构域。结论:FBLN1可能参与ERβ信号途径并共同调节细胞的增殖。ERβ与FBLN1相互作用的发现为进一步研究ERβ与FBLN1在生理及病理中的作用奠定了基础。     

LRP16与 ERα相互作用增强ERα介导的转录活性

LRP16是一个雌激素（E2）通过受体α（ERα）诱导表达的靶基因,LRP16不仅促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,而且促进细胞的侵袭生长,但对LRP16作用的分子机制尚不清楚.首先,检测到LRP16表达缺陷明显削弱了MCF-7细胞对E2的反应性增殖能力;采用Northern 印迹与Western印迹法,进一步检测到抑制LRP16表达,明显损害了ERα靶基因对E2诱导上调的反应性,这些基因包括了cyclin D1, c-myc, c-fos,MTA3, pS2和维甲酸受体α基因（RARα）等;以上结果提示,LRP16参与了ERα介导的信号途径.将ERα模式启动子报告基因3×ERE-TATA-luc,ERα以及LRP16表达载体共转染MCF-7与HeLa细胞.结果发现,LRP16增强了ERα对报告基因的转录激活,并呈现对LRP16的剂量依赖性;进而采用GST-pull down以及免疫共沉淀方法证实了LRP16与ERα之间的直接相互作用,该作用不依赖于E2的存在,但可被E2增强;采用哺乳动物双杂交方法进一步证实了ERα与LRP16相互作用位点存在于A/B区的激活功能域-１（AF1）.以上结果表明,LRP16是ERα的一个共激活因子,通过相互作用,LRP16增强了ERα介导转录活性.该研究为LRP16促进ERα阳性乳腺癌细胞增殖与侵袭生长提供了合理的分子解释.     

多功能转录因子CTCF结构域的转录活性研究

目的:CTCF是广泛存在于真核生物中的多功能转录因子。利用细胞瞬时表达实验在HeLa细胞系中研究CTCF各结构域的转录活性。方法:借用CheckMate哺乳动物双杂交系统的2个质粒pBIND和pG5LUC,将CTCF的N、M、C段及全长编码序列克隆至pBIND质粒的GAL4DNA结合结构域编码序列后的多克隆位点,将表达GAL4DNA结合结构域-CTCF融合蛋白的pBIND重组质粒与由腺病毒晚期主要启动子控制的报告基因质粒pG5LUC共转染HeLa细胞系,检测CTCF各结构域对报告基因表达水平的影响。结果:转染含CTCFN段的质粒可使报告基因的表达量增长至3.5倍以上;转染含CTCF其他片段的质粒对报告基因的表达没有明显的影响。结论:在HeLa细胞中,对启动子具有转录激活活性的主要是CTCF的N段,而M段和C段几乎没有转录激活活性。     

TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的构建、表达及生物活性鉴定

目的:构建TANK结合激酶1(TBK1)相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,检测该基因相关突变体在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:根据文献报道的突变序列及QuickChange Site-Directed Mutagenesis实验设计手册,设计合成2条针对TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的引物,以实验室之前构建的TBK1野生型真核表达载体为模板,构建TBK1激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,分别命名为pcDNA3-Flag-TBK1(KD)、pcDNA3-Flag-TBK1(ΔULD)。以LipofactAMINE2000转染试剂转染至293细胞中进行瞬时表达,利用萤光素酶实验检测2种TBK1突变体诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体真核表达载体构建成功,Western印迹检测表明其在293细胞中获得有效表达;用萤光素酶报告基因实验检测,与野生型TBK1相比,其相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体诱导IFN-β转录激活的作用明显降低。结论:真核表达的TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。