人白细胞介素-3基因在酿酒酵母中的分泌表达

利用PCR突变方法,改造了人白细胞介素-3(hIL-3)cDNA,在成熟蛋白编码顺序5＇端前突变入了XbaⅠ酶切位点和酵母类胰蛋白酶加工位点Lys-Arg的密码子。改造后的hIL-3cDNA插入大肠杆菌-酵母穿梭质粒pVT102u/α,使其准确融合于α-交配因子前导序列之后,并置于启动子ADH1调控之下。转化入酿酒酵母宿主菌S-78筛选后,30℃培养48h,上清能明显促进hIL-3依赖细胞TF-1生长。上清中分泌表达的hIL-3经ELISA鉴定并定量,其表达量大于1.0mg/L。~3H-TdR掺入法测定上清中hIL-3活性为1.8×10~3u/ml。     

人促红细胞生成素基因的合成及在大肠杆菌中的表达

人促红细胞生成素(简称hEPO)是一种能够促进祖红细胞分化发育并进而促进红细胞生成的细胞生长因子,它在临床上可用以治疗某些贫血病人特别是由于慢性肾衰所引起的肾性贫血^〔1－3〕．hEPO是一种由166个氨基酸组成的糖基化蛋白质．它的前体还带有27个氨基酸的信号肽^〔4－6〕。有两对由Cys7-Cys161和Cys29－Cys33组成的二硫键,其糖基化位点为Ash--24。Ash一38．Asn一83和Ser一126^〔7－8〕。由于天然来源hEPO的量极少．因此通过基因工程的手段是当前获得大量hEPO的较好的途径^〔9－10〕。我们在前文中曾经报道用单链方法合成天花粉胰蛋白酶抑制荆基因〔11〕以及用单链和PCR相结合来合成绿豆胰蛋白酶抑制荆基因的方法〔12〕．我们在合成hEPO基固(包括带有信号肽的hEPO基因)时也采用了这两种方法：合成的hEPO基因在大脑杆菌、CHO细胞和昆虫细胞中均得到表达。本文报道hEPO基因的合成及在大肠杆菌中的表达结果。     

抗金属螯合四肽单抗ScFv基因在大肠杆菌中的表达

作者将获得的抗３株金属螯合四肽单克隆抗体的轻,重链可变区基因,通过ｌｉｎｋｅｒ连接成单链基因,并在其后插入编码ＣＧＲＰ的Ｎ端前十三肽的３９ｂｐ基因片段,组成Ｌｖ－ｌｉｎｋｅｒ－Ｈｖ－ＣＧＲＰ,将该基因克隆入分泌表达载体ｐＴＣ０１中,获得实物。     

抗人AFP抗体噬菌体呈现文库的构建筛选及基因序列测定

从人ＡＦＰ免疫小鼠脾细胞ｍＲＮＡ中扩增出全套抗体Ｖ区基因并随机拼接为ＳｃＦｖ,构建全套ＳｃＦｖ基因噬菌体呈现文库,经两轮ｐａｎｎｉｎｇ筛选富集,一次从９４个单个重组噬菌体克隆中筛选到１４个具有ＡＦＰ结合活性的克隆,测定两个阳性克隆中ＳｃＦｖ基因的核苷酸序列,获得一个ＶＨ基因和两个ＶＫ基因,其基因序列分别与鼠Ｉｇ ＶＨｊＪ５５８,ＶＫ－ＯＸ１和ＶＫ４／５家族同源性最高,推导出的氨基酸序列中均含有抗体     

脯氨酰内肽酶培养条件的优化及高密度发酵

基因工程菌E.coliBL21/pGEMPEP可以组成型表达重组的点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(PEP),但培养条件极大地影响着酶的产量,为了获得高效表达,首先测定了工程菌表达PEP的稳定性并考察了培养温度、pH、发酵时间、碳源、氮源、无机盐等对产酶的影响,得到了优化的发酵条件,L9(3⁴)正交试验进一步明确了摇床转速、培养温度、pH值、培养时间对产酶量的影响都有高度的统计学意义。在此基础上利用NBSBioFlo3000型5L自控发酵罐进行了高密度、高表达发酵、经20h培养,最终菌体密度达OD₆₀₀60(相当于干菌体225g/L),PEP表达量为28%,每升发酵液中含PEP酶315g。     

人前列腺特异膜抗原膜外区基因的克隆表达及抗体的制备

利用RT PCR技术 ,从前列腺癌组织总RNA中扩增人前列腺特异膜抗原 (PSMA)基因编码区序列 ,克隆至pcDNA3.1载体 ,以此为模板再次PCR扩增出PSMA膜外区cDNA(edPSMA) ,序列测定表明克隆获得的PSMA及edPSMA与基因库所登录的序列相一致。构建原核表达质粒pMAL c2x edPSMA ,经IPTG诱导表达的MBP edPSMA融合蛋白分子量约 12 0kD ,Westernblot证实表达产物可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合。用直链淀粉琼脂糖凝胶 (Amyloseresin)亲和层析纯化蛋白质可得到电泳均一的融合蛋白 ,免疫BALB C小鼠制备多抗 ,获得效价为 1∶12 80 0的多克隆抗体 ,该抗体可用于前列腺癌组织标本PSMA表达的检测     

低毒且高效杀伤人肿瘤细胞的新型人肿瘤

采用定点突变的方法构建了两株新型人肿瘤坏死因子突变体MT1 (32Trp157Phe)和MT2(2Lys30Ser32Trp157Phe), 并在大肠杆菌中得以高效表达, 表达量占菌体总蛋白的50%且为可溶性蛋白. 表达产物经蛋白印渍法检测, 均能与抗野生型hTNF-a单抗结合且经分离纯化后样品的纯度在95%以上. 各突变体虽然对鼠成纤维瘤细胞L929的生物学活性比野生型下降了4~5个数量级, 但却能高效杀伤人肿瘤细胞, 杀伤程度与野生型相差不明显. 测定突变体MT1的LD50值降至野生型的0.34%, 而MT2对小鼠30%致死剂量则低于野生型LD50的1/700.