LRP16通过调控E-钙粘合素的表达促进MCF-7细胞的侵袭生长

LRP16在原代乳腺癌组织中表达水平与雌激素受体α（ERα）表达状态以及腋窝淋巴结侵袭数目密切相关.为研究LRP16基因对乳腺癌MCF-7细胞侵袭生长的影响,并探讨涉及的分子机制,采用基质胶黏附实验与Transwell方法,检测内源性LRP16表达抑制MCF-7细胞的体外黏附、侵袭生长与迁移特征.结果表明,抑制LRP16在MCF-7细胞中的表达,降低了细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力;采用FVB小鼠进行的实验性转移试验结果显示,抑制LRP16显著降低了MCF-7细胞的肺转移结节数目;为探索可能的分子机制,采用Western印迹方法,检测了LRP16对乳腺癌转移相关分子MMP-2, MMP-9, CD44和E-钙黏着蛋白表达的影响,结果在LRP16抑制的MCF-7细胞中只有E-钙黏着蛋白蛋白表达上调.进一步的Northern印迹与免疫组化实验结果表明,抑制LRP16可上调MCF-7细胞中E 钙黏着蛋白基因的mRNA与蛋白表达水平;共转染与双荧光素酶方法检测LRP16对E-钙黏着蛋白基因启动子的表达调控效应,结果显示,LRP16抑制E 钙黏着蛋白基因基因5′-近端启动子的转录激活,该抑制效应选择性存在于内源性ERα阳性细胞,并且依赖于雌激素的存在;染色质免疫共沉淀方法（ChIP）检测ERα与E-钙黏着蛋白基因启动子的相互作用,结果显示,在LRP16基因表达缺陷的MCF-7细胞中,ERα抗体沉淀到E-钙黏着蛋白基因启动子的DNA序列;上述研究结果表明,抑制LRP16基因表达,削弱了激素依赖型乳腺癌细胞的侵袭生长能力,其分子机制涉及了LRP16通过ERα介导对E-钙黏着蛋白基因基因转录激活的调控.     

ERα的辅调节因子与乳腺癌关系的研究进展

雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）是配体依赖的转录因子,属于核受体超家族成员。ERα介导转录的经典途径是与雌激素结合后作用于靶基因启动子区的雌激素反应元件（estrogen response element,ERE）,进而诱导靶基因转录。ERα招募辅调节因子（共激活子和共抑制子）参与ERα介导的基因转录调控。辅调节因子主要通过乙酰化、磷酸化、甲基化等表观遗传机制参与转录调控,影响靶蛋白表达水平。ΕRα介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭转移等过程中发挥重要作用。综述在ERα介导的基因转录调控中几类辅调节因子对乳腺癌发生发展的影响。     

LRP16对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

用Northern印迹方法检测雌二醇 (17β E2 )对LRP16mRNA表达的时间及剂量依赖性调控作用 .构建LRP16基因启动子序列调控的萤光素酶报告子 (pS0 ) ,并与雌激素受体α和 β(ERα和ERβ)表达载体共转染COS 7和MCF 7细胞后测定萤光素酶活性 .将LRP16基因的表达载体转染MCF 7细胞 ,测定过表达LRP16对细胞的生长特性的影响 .17β E2 使MCF 7细胞中LRP16mRNA表达水平增加 ,增加幅度未显示出 17β E2 培养时间和剂量的依赖性 .pS0 与ERα表达载体共转染细胞的相对萤光素酶活性较非共转染组 (对照组 )及pS0 ERβ表载体共转染组升高 5～ 10倍 .LRP16基因过表达促进MCF 7细胞的增殖 .研究表明 ,雌激素可能通过ERα上调乳腺癌MCF 7细胞LRP16基因的表达并促进细胞增殖     

LRP16基因通过雌激素受体α介导抑制Ishikawa细胞中E-钙黏着素的转录活性

目的:既往研究表明LRP16基因过表达通过下调E-钙黏着素促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的侵袭生长,本研究目的在于探讨LRP16基因下调E-钙黏着素的分子途径。方法:用免疫组化方法检测LRP16基因过表达的Ishikawa细胞中E-钙黏着素的表达;用共转染与荧光素酶实验检测LRP16基因对E-钙黏着素启动子转录活性的影响;用染色质免疫共沉淀实验检测雌激素受体α(ERα)与LRP16蛋白在E-钙黏着素启动子区的招募状况。结果:E-钙黏着素在LRP16过表达的Ishikawa细胞中的表达水平明显下调;LRP16抑制了E-钙黏着素启动子的转录活性,该效应呈现对雌激素(E2)存在的依赖性特征;LRP16本身没有与E-钙黏着素启动子区结合,但明显抑制了ERα与E-钙黏着素启动子区的结合。结论:LRP16通过抑制ERα对E-钙黏着素基因的转录激活活性,下调E-钙黏着素在Ishikawa细胞中的表达水平。     

ERα辅调节因子在乳腺癌中的双重调控作用

在发达国家,乳腺癌一直是威胁女性健康的恶性肿瘤之一。雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)是一种配体依赖性的转录因子,其介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭和转移等过程中发挥重要作用。ERα主要依赖于辅调节因子共同调控下游靶基因的表达。近年来,有研究证实,一些关键转录辅调节因子在调节ER转录活性的同时,也可以作为泛素E3连接酶,促进ERα的降解。该文详细介绍几种辅调节因子对ERα的双重调节作用,有助于从分子水平阐明不同类型乳腺癌中造成ERα表达量差异的机制,为乳腺癌的靶向治疗和预防提供理论依据。     

抑制LRP16基因的表达显著下调TNF-α介导的NF-κB转录活性

LRP16是1个雌激素(E2)通过其受体α(ERα)诱导表达的靶基因.研究表 明,LRP16可以作为多种核受体（包括AR、ERα）的转录共激活因子.采用荧光素酶报 告检测显示,抑制LRP16基因表达显著削弱了TNF-α(10 ng/mL)介导的NF-κB转录活性;采用免疫荧光和Western印迹法研究抑制LRP16对NF-κB/p65亚基核转位的影响,结果显示,抑制LRP16表达并不能参与影响p65亚基核转位．上述结果提示,LRP16可能以核激活因子角色参与了NF-κB介导的信号途径．RT-PCR实验检测抑制LRP16基因表达对TNF-α诱导NF-κB靶基因调控作用,检测的靶基因包括IκB、A20、IL-8、 FLIP、XIAP.结果表明,在这些靶基因中只有XIAP、cIAP2产生了明显的下调趋势. 因此,LRP16是NF-κB的1个共激活因子,通过调控NF-κB与靶基因的结合能力,从而增强了NF-κB的转录活性.     

小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF-7乳腺癌细胞增殖

雌激素雌二醇上调人乳腺癌细胞MCF 7中LRP16基因表达 ,该基因过表达促进MCF 7细胞增殖 .为进一步探讨LRP16基因不同表达水平对MCF 7细胞增殖的影响以及对雌激素的反应性增殖能力 ,采用针对LRP16基因特异的小干扰RNA策略 ,通过逆转录病毒介导及抗性筛选构建了LRP16基因被稳定抑制的 2个MCF 7细胞系 ,针对绿色荧光蛋白的干扰序列作为阴性对照 .Northern印迹实验检测了LRP16基因在各个细胞株中mNRA的水平 ,与对照组细胞比较 ,针对LRP16基因不同位置的 2个小干扰RNA可分别将该基因抑制 90 %和 6 0 % .细胞增殖试验结果显示 ,MCF 7细胞中LRP16基因表达抑制率越高 ,细胞增殖速率减慢越显著 (P <0 0 5 ) ;软琼脂集落形成试验结果显示 ,抑制LRP16基因在MCF 7细胞中表达 ,限制了细胞锚定非依赖性生长 ;细胞周期分析结果表明 ,LRP16基因抑表达使MCF 7细胞G1 S周期转换受抑 ;Western印迹结果表明 ,LRP16基因表达抑制的细胞中细胞周期蛋白E及细胞周期蛋白D1蛋白水平显著下调 ,但未检测到P5 3及Rb蛋白表达水平的影响 .雌二醇刺激的增殖实验结果显示 ,抑制LRP16基因表达没有消除MCF 7细胞的反应性增殖特征 .上述结果表明 ,LRP16基因表达量与MCF 7细胞增殖能力密切相关 ,抑制其表达可有效限制MCF 7细胞的增殖能力 ,提     

雌激素通过LRP16基因5′侧翼GC富含区上调其转录的分子机制

LRP16是一个明确的雌激素(E2)反应性靶基因,已往研究在LRP16基因上游调控区鉴定了一个E2反应性1/2ERE/GC富含的ERα作用位点（-676 bp到-214 bp;命名为A区）.为进一步鉴定雌激素上调LRP16基因表达的最大化反应区域,对LRP16基因上游调控区进行缺失突变,通过相对荧光素酶活性分析观察到LRP16基因的一段5′近端侧翼序列（-213 bp到-24 bp;命名为B区）具有明显的E2反应性.通过与A区比较,认为B区最大化的呈递了E2对LRP16基因的转激活效应.序列分析表明,B区缺乏经典的ERE元件,而包含多个富含GC序列.针对Sp1的siRNA实验结果提示,Sp1参与了E2对该区域的转激活.针对GC富含区进一步的缺失突变,及荧光素酶活性分析,识别了一段30 bp（-213 bp到-184 bp）的序列在B区呈递E2反应活性中发挥核心作用.超级凝胶电泳实验结果表明,Sp1蛋白与这段30 bp的DNA序列在体外存在直接结合作用.染色质免疫共沉淀实验结果证实,ERα、Sp1与B区存在E2依赖性相互作用.本文在LRP16的5′侧翼区识别了一段最大化呈递E2活性的DNA片段.机制研究表明,在E2存在条件下,ERα通过Sp1与该区域的直接作用上调LRP16基因的表达.     

新的ER下游靶基因BAP18的鉴定及其在ER阳性乳腺癌中的作用

雌激素受体(ER)/雌二醇(E2)调控其下游靶基因的转录及蛋白表达,在乳腺癌的发生发展过程中发挥至关重要的作用,寻找新的ER下游靶基因可以为乳腺癌的临床治疗提供新的治疗靶点。该研究通过Western blot和qPCR方法确定了一个新的ER下游靶基因BAP18,其表达量可以被E2和ER上调,同时使用拮抗E2和ER的药物如他莫昔芬或氟维斯群可以使BAP18表达量下降。通过生物信息学分析确定了BAP18转录起始位点前潜在的ER结合位点,构建了检测BAP18转录活性的质粒后,用荧光素酶双报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验确定了BAP18启动子上ER的结合位点和上调转录的区域。凝胶迁移实验确定ER可以直接结合BAP18的启动子DNA。最后利用CRISPR-Cas9定向敲除BAP18,发现BAP18的敲除可以导致ER阳性乳腺癌细胞的生长和增殖减慢且凋亡增加。该研究鉴定了BAP18是ER下游靶基因,其在乳腺癌中有促癌作用。BAP18的发现有望为ER阳性乳腺癌的临床治疗提供理论基础和新的治疗靶点。     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

ERα与Sp1相互作用激活LRP16启动子转录活性

根据已报道的LRP1 6启动子序列 (2 6kb) ,采用PCR反应获得 6个启动子 5′删除突变体 ,分别插入pGL3 Basic载体 ,构建 6种 5′缺失报告基因表达载体 (pS1 ～pS6) .分别与ERα真核表达载体共转染MCF 7细胞 .用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性 ,以明确LRP1 6基因上游启动子区域中的雌激素反应序列 .结果显示 ,pS1 ～pS6均有雌二醇反应性 .进而对pS5的 3′端缺失分析发现LRP1 6基因翻译起始位点上游 - 2 1 4至 - 2 5 1位置的序列具有雌激素应答 ,序列分析发现该片段序列中包含了一个供转录因子Sp1结合的GC富含位点和一个ERα反应元件的半位点 (1 2ERE Sp1 ) ,进一步突变分析显示这两个元件均为雌激素反应性所必需 .以含这两个顺式元件的序列 (- 2 5 3bp至 - 2 2 4bp)作为探针 ,超级迁移凝胶电泳试验结果表明了ERα和Sp1蛋白均可以和探针结合 .研究发现了雌激素上调LRP1 6基因表达的一个增强子元件— 1 2ERE Sp1 ,ERα和Sp1蛋白需要与DNA结合形成复合体 ,通过其相互作用激活转录     

培养的血管平滑肌细胞ERα和ERβ的表达与细胞表型转变及增殖时相有关

目的探讨雌激素对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的双重效应机制。方法采用Westernblot、电镜形态定量及细胞计数的方法,动态检测原代培养大鼠VSMC在有或无10^-8mol/L17β-雌二醇（E2）存在下,雌激素受体（ER）α和β表达变化与细胞表型转变及增殖时相的关系。结果无E2存在时,VSMC在从收缩型向合成型转变（原代培养第0到5天）及活跃增殖（第5到12天）过程中,ERβ表达无明显变化,但ERα表达明显上升,导致ERα/ERβ比值升高。这种变化并不随VSMC表型的恢复及增殖停止而逆转。有E2存在时,ERα/ERβ比值在第5天时低于对照组,而第9天后各时点均高于对照组;这种影响与E2对不同状态VSMC的不同作用基本对应,即延长原代收缩型SMC的增殖潜伏期,但促进已发生表型转变的VSMC增殖。结论雌激素对不同表型VSMC的双重效应与表型转变前后ERα/ERβ比值变化有关。     

雌激素受体α真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体α（ERα）高效真核表达载体,并检测其转录活性。方法：用常规PCR方法特异扩增带有Flag标签的人ERα全长编码序列,经双酶切后将其克隆到真核表达载体pIRESpuro2中,构建重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERα;用Westernblot鉴定该重组质粒介导的Flag-ERα在人胚肾细胞株293T中的表达情况;用含雌激素应答元件的报告基因系统检测ERα的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERα重组质粒,该质粒介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含雌激素应答元件的报告基因的活性。结论：ERα高效真核表达载体的构建为进一步研究ERα在乳腺癌中的作用奠定了基础。     

雌激素通过LRP16基因5′侧翼GC富含区上调其转录的分子机制

LRP16是一个明确的雌激素(E2)反应性靶基因,已往研究在LRP16基因上游调控区鉴定了一个E2反应性1/2ERE/GC富含的ERα作用位点(-676bp到-214bp;命名为A区).为进一步鉴定雌激素上调LRP16基因表达的最大化反应区域,对LRP16基因上游调控区进行缺失突变,通过相对荧光素酶活性分析观察到LRP16基因的一段5′近端侧翼序列(-213bp到-24bp;命名为B区)具有明显的E2反应性.通过与A区比较,认为B区最大化的呈递了E2对LRP16基因的转激活效应.序列分析表明,B区缺乏经典的ERE元件,而包含多个富含GC序列.针对Sp1的siRNA实验结果提示,Sp1参与了E2对该区域的转激活.针对GC富含区进一步的缺失突变,及荧光素酶活性分析,识别了一段30bp(-213bp到-184bp)的序列在B区呈递E2反应活性中发挥核心作用.超级凝胶电泳实验结果表明,Sp1蛋白与这段30bp的DNA序列在体外存在直接结合作用.染色质免疫共沉淀实验结果证实,ERα、Sp1与B区存在E2依赖性相互作用.本文在LRP16的5′-侧翼区识别了一段最大化呈递E2活性的DNA片段.机制研究表明,在E2存在条件下,ERα通过Sp1与该区域的直接作用上调LRP16基因的表达.     

Mir-26a调控子宫肌瘤中孕激素受体a(PRa)、雌激素受体α(ERα)的表达

目的:雌激素和孕激素在子宫肌瘤发病中起重要作用。但miRNA在子宫肌瘤发病中的作用还知之甚少,我们前期已证实mir-26a在子宫肌瘤中低表达,本实验进一步探讨mir-26a在体外对子宫肌瘤中孕激素受体a(PRa)、雌激素受体α(ERα)表达的调控。方法:利用TargetScan软件预测mir-26a的潜在靶基因,找出靶基因3'UTR区片段,插入PmirGLO绿色荧光蛋白编码区下游,构建报告基因载体,同时原代培养子宫肌瘤平滑肌细胞。将报告基因载体与mir-26a共转染入原代培养的子宫肌瘤平滑肌细胞,引入双荧光素酶报告基因系统对mir-26a的靶基因进行验证。转染mir-26amimics于子宫肌瘤平滑肌细胞,westernblotting检测子宫肌瘤平滑肌细胞中mir-26a靶蛋白表达水平。结果:用TargetScan软件和双荧光素酶报告基因系统证实ERα、PRa为mir-26a的靶基因。蛋白水平进一步验证,mir-26amimics的转染量不同,ERα、PRa的蛋白表达水平下调不同。结论:Mir-26a通过结合靶基因的3'-UTR区调控靶基因的mRNA水平。Mir-26a抑制雌激素受体α(ERα)、孕激素受体a(PRa)在子宫肌瘤中的表达。Mir-26a可能通过调控雌激素受体α(ERα)、孕激素受体a(PRa)影响子宫肌瘤的发展。本实验通过确定mir-26a对子宫肌瘤的作用机制,有望进一步提高子宫肌瘤的治疗技术,减少手术治疗的创伤。     

LRP16影响电离辐射诱导的NF-κB活性

目的:研究LRP16在电离辐射激活核转录因子NF-κB信号转导通路中的作用。方法:在HeLa细胞中,分别运用双萤光素酶分析和Western印迹检测LRP16对κB-Luc报告基因及NF-κB下游靶基因表达的影响。结果:双萤光素酶实验证实LRP16过表达促进电离辐射诱导的κB-Luc活性,而抑制LRP16则降低电离辐射诱导的κB-Luc活性;Western印迹结果显示,LRP16过表达促进电离辐射诱导NF-κB的下游抗凋亡基因XIAP的表达,与之相对应的是,抑制LRP16降低电离辐射诱导NF-κB下游抗凋亡基因XIAP的表达。结论:LRP16可以调节电离辐射诱导NF-κB的转录活性,并且调控NF-κB下游抗凋亡基因XIAP的表达,为进一步阐明电离辐射激活NF-κB转录活性的分子机制奠定了基础。     

肝癌细胞雌激素受体显性阴性突变体ERδ5基因的分离及生物学功能分析

临床流行病学研究显示,ERα基因第5外显子缺失突变体ERδ5在原发性肝细胞癌特异性高表达,它被认为是判断肝癌预后的最重要的新型分子标志.本研究从肝癌细胞分离雌激素受体突变体ERδ5基因,并对其进行克隆、表达,探讨其分子生物学特性及生物学功能. 通过反转录PCR,从肝细胞分离出ERδ5基因并将其克隆到真核表达载体,通过体外翻译及Western 印迹验证该基因成功表达;通过细胞荧光技术检测了ERδ5在肝细胞中的定位;利用荧光素酶报告基因检测技术确证ERδ5对ERα转录活性的影响.结果发现,从肝癌细胞分离出长1 113bp的ERδ5基因,该基因编码蛋白在体外不稳定,易于降解.在肝癌细胞中,ERδ5蛋白主要定位在细胞核,与ERα定位极为相似,但在生物学功能上,ERδ5能够明显干扰ERα的转录活性.研究结果表明,ERδ5作为显性阴性突变体,在肝癌细胞中直接抑制ERα的转录活性.     

敲除ESR1基因对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的:建立CRISPR/Cas9系统用于敲除人源雌激素受体α(ERα)基因(ESR1),并利用此细胞模型初步检测ESR1基因对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法:设计一个靶向人源ESR1基因第2外显子的单向导RNA(sg RNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人乳腺癌细胞株MCF-7,Western印迹检测MCF-7中ESR1基因的敲除效果,通过Transwell、反向侵袭试验观察ESR1基因敲除后对细胞侵袭能力的影响。结果:测序结果显示靶向ESR1基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;Western印迹显示Cas9-ERα组的MCF-7细胞内ERα表达水平较对照组显著降低;Tanswell、反向侵袭试验证实ESR1基因敲除能够促进乳腺癌细胞的侵袭能力。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向ESR1基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除ESR1基因;ERα能够抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。     

UHRF1通过miR-206调控ERα表达促进甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移

该研究探讨了泛素样含PDH和环指域1(UHRF1)对甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)细胞增殖、侵袭和迁移的影响。应用Real-time PCR检测正常甲状腺细胞Nthyori3-1、甲状腺乳头状癌细胞BCPAP和K1中UHRF1 mRNA、miR-206和ERαmRNA的表达水平;Real-time PCR检测UHRF1过表达或干扰对miR-206和ERαmRNA的表达影响;MTT、Transwell检测UHRF1过表达或干扰对Nthy-ori3-1、BCPAP、K1细胞增殖、侵袭和迁移影响;Western blot和双荧光素酶报告实验分析miR-206与ERα的靶向关系。结果表明,与Nthy-ori3-1细胞相比,BCPAP和K1细胞中UHRF1 mRNA和ERαmRNA表达水平显著增高(P<0.05),而miR-206表达水平显著降低(P<0.05);UHRF1过表达或干扰处理细胞后,miR-206表达水平与之变化趋势相反,而ERα表达水平与之变化趋势相同;UHRF1促进Nthy-ori3-1、BCPAP和K1细胞增殖、侵袭和迁移;Western blot和双荧光素酶报告实验证实,miR-206靶向ERα基因并抑制其表达。以上结果说明,UHRF1可通过miR-206调控ERα表达,促进甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移。     

ERα-36和STAT3协同促进乳腺癌细胞的迁移

[目的]探讨ERα-36和STAT3通过MMP2和MMP9对乳腺癌细胞迁移的影响。[方法]使用Transwell实验检测ERα-36和STAT3对乳腺癌细胞迁移能力的影响,荧光定量PCR和Western Blot检测在乳腺癌细胞中过表达ERα-36和STAT3对MMP2和MMP9表达的影响,Luciferase实验检测ERα-36和STAT3对MMP2和MMP9启动子转录活性的影响。[结果]与对照组相比,过表达STAT3组的乳腺癌细胞迁移能力明显升高(P 0. 05),两种与迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达量均升高(P 0. 05);过表达STAT3增强了乳腺癌细胞中MMP2和MMP9的转录活性,而ERα-36过表达对MMP2和MMP9的转录活性具有较弱的影响。但是共表达ERα-36和STAT3显著增强了MMP2和MMP9的转录活性与表达。[结论]ERα-36和STAT3协同结合到MMP2和MMP9的启动子上,促进它们的转录与表达进而促进乳腺癌细胞迁移。