小鼠canstatin及其N端片段在大肠杆菌BL21 中的表达

以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin及其N端片段基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin及其N端片段基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,分别构建表达质粒pET/Can和pET/Can-N, 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达。结果表明: 小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。小鼠canstatin N端片段(1-95aa)与人的同源性为100%。 IPTG诱导原核表达载体pET/Can和pET/Can-N在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的35% 和 18%, 重组蛋白主要以包涵体形式存在。文中报道的小鼠canstatin 及其N端片段核苷酸序列已收入GenBank, 接受号分别为: AY375463和AY502946。Abstract:The mouse canstatin and its N-domain cDNA were amplified from total RNA of mouse liver by RT- PCR and cloned into vector pMD18-T for sequencing. Prokaryotic expression vectors pET/Can and pET/Can-N were constructed and expressed in E.coli BL21(DE3) with induction of IPTG.. Mouse canstatin cDNA is 684bp in length encoding 227 amino acids. The sequences of both cDNA and amino acids share high homology with human canstatin, with cDNA identity at 89% and amino acids identity at 96% to human canstatin. N-domain of mouse canstatin is the same amino acid sequence as that of human canstatin. In the present study, prokaryotic expression vector pET/Can and pET/Can-N were expressed in E.coli BL21 with amount of 35% and 18% of the total bacterial proteins after being induced by IPTG for 4h. The expressed products existed mainly as inclusion bodies. This work has laid down the basis for further study of its angiogenic activity and potential application for tumor dormancy therapy.     

重组小鼠canstatin N端片段对鸡胚新生血管生成的抑制作用(英)

为了研究重组小鼠canstatin N端片段的体内抗血管生成活性, 通过PCR扩增小鼠canstatin N端片段cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建小鼠canstatin N端片段重组表达载体pET-mCanN, 转化E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹检测小鼠canstatin N端片段的表达. 结果表明,IPTG诱导原核表达载体pET-mCanN在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中高效表达, 小鼠canstatin N端片段表达量约占菌体总蛋白量的18%, 小鼠canstatin N端片段主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、裂解、Ni-spin column亲合柱层析以及蛋白质复性等步骤纯化后,获得了纯度约为92%的重组小鼠canstatin N端片段. 鸡胚绒毛尿囊膜(chicken embryo choriollantoic membrane,CAM)实验表明,原核表达的小鼠canstatin N端片段能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成.     

柽柳翻译起始因子(eIF-5A)基因的克隆及原核表达

根据柽柳cDNA文库中获得的eIF-5A基因片段,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.cDNA长度为799 bp,编码159个氨基酸.将该cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-eIF5A.不同浓度NaCl胁迫下大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(pET28a-eIF5A)比E.coli BL21(pET28a)有明显的抗盐性,前者菌株存活率在1.0 mo1·L-1NaCl盐胁迫下是后者的9.3倍,据此认为E.coliBL21(pET28a-eIF5A)的耐盐性可能与eIF-5A基因的表达相关.该基因的GenBank登录号为AY587771(基因)、AAT01416(蛋白).     

人MGMT基因Cdna的克隆表达及表达蛋白修复功能的鉴定

克隆了Hela细胞O6 甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶 (MGMT)基因的cDNA序列 ,该序列与国外发表的cDNA完全一致。将此cDNA插入原核表达载体pET 2 1a后转化大肠杆菌BL2 1(DE3)获得表达的重组菌株pET 2 1a MGMT E .coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导后产生分子量为 2 4kD的蛋白质。烷化类诱变剂致死突变实验表明 ,MGMT蛋白的表达能修复受体菌DNA分子因烷化类诱变剂导致的突变。     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

蜘蛛大壶状腺丝蛋白基因的克隆和原核表达

以悦目金蛛(Argiope amoena)丝腺SMARTRACEcDNA文库为模板进行RT-PCR,克隆了1条大壶状腺丝蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)基因cDNA序列。该条cDNA序列编码的氨基酸序列可区分为两部分(1)富含丙氨酸的片段和富含甘氨酸的片段相间排列构成的重复氨基酸序列区,并且富含甘氨酸的片段中有脯氨酸分布;(2)约100个氨基酸残基组成的C末端非重复氨基酸序列区。把MaSp基因cDNA序列亚克隆到质粒pET28b( )中,构建原核表达质粒pET28b( )-MaSp,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、氨基酸组成测定和N末端氨基酸序列测定的结果表明,表达产物为重组MaSp,表达量约为40mg/L。还对C末端非重复氨基酸序列对重组MaSp在水媒介中溶解性的影响进行了探讨。     

小鼠HSP60基因的克隆与表达条件的优化

目的:克隆小鼠热休克蛋白60(HSP60)基因,在大肠杆菌中表达,并进一步对其表达条件进行优化.方法:采用RTPCR技术克隆出非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠HSP60的cDNA序列.构建重组表达载体pET28a- HSP60,以其转化大肠杆菌感受态细胞BL21( DE3),在不同的菌体浓度、不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间以及不同温度条件下诱导,检测重组蛋白的表达情况.结果:获得一个含有1 721bp的cDNA的片段,重组蛋白HSP60在E.coli BL -21 (DE3)中的最佳表达条件是菌体密度A600nm为0.6,诱导时间为5h,诱导物(IPTG)浓度为4mmol/L,诱导温度为35℃,重组蛋白大小约为60kD.结论:成功克隆了小鼠HSP60基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,为重组蛋白的分离纯化及进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

重组小鼠树突状细胞因子DCF1的原核表达和纯化

目的:克隆小鼠重组树突状细胞因子DCF1蛋白进行原核表达、纯化与鉴定.方法:采用PCR从小鼠脑cDNA克隆dcf1基因,构建DCF1原核表达重组质粒(pET30a-DCF1)并转化E.coli的BL21(DE3)菌株.IPTG诱导重组蛋白表达,并在变性条件下经Ni sepharose FF6亲和层析柱纯化,再通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定.结果:成功克隆到大小为972bp的小鼠源dcf1基因片段并准确插入表达载体pET30a,0.1 mmol/L IPTG诱导转化菌2h可表达大量的DCF1蛋白,并可经Ni Sepharose FF6柱亲和层析得到高度纯化.结论:成功获得纯化的42kDa重组小鼠DCF1蛋白,为后续进行DCF1蛋白功能研究奠定了基础.     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:通过佛波酯(TPA)和植物球血凝素(PHA)刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a-IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论:成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

小鼠β-防御素30的原核表达和纯化

目的:在原核细胞中表达小鼠β-防御素30(DEFB30),并对表达产物进行鉴定和纯化。方法:用RT-PCR方法扩增小鼠Defb30的cDNA序列,将2个拷贝的cDNA序列串联连入原核表达载体pET28(a),构建重组表达载体pET28(a)-Defb30,并将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,以Western印迹分析表达产物His-DEFB30,用Ni-NTA亲和柱纯化融合蛋白。结果:构建了Defb30基因的原核表达载体,经IPTG诱导,相对分子质量约15×103的融合蛋白获得表达,Western印迹分析证实此蛋白即为目的蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化,获得了高纯度的融合蛋白His-DEFB30。结论:获得了在大肠杆菌中表达的DEFB30,为研究该蛋白的免疫避孕效果、抗菌活性奠定了基础。     

人血管能抑素基因的克隆、表达及其表达产物的纯化和生物活性测定

以人胎盘脐带组织为材料,提取组织总RNA,用netRTPCR方法合成人血管能抑素cDNA基因,将该cDNA克隆进pSP72载体获得重组质粒pSP72C, DNA序列分析结果与预期序列一致。用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切,切下pSP72C上的血管能抑素cDNA,插入pET3c载体的相应位点获得重组表达质粒pETC, 转化E. coli BL21(DE3), SDSPAGE分析显示：在IPTG诱导下,血管能抑素基因获得了高效表达,表达量约占菌体总蛋白的 27.9 %,主要以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤、裂解、蛋白复性以及Sephadex G75凝胶过滤层析等步骤后,获得了纯度达91.4 %的人血管能抑素。CAM实验证明10 μg纯化蛋白就能显著抑制鸡胚新生血管生成。     

猪肌肉素基因的cDNA克隆与表达

从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。     

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明,该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基,其中对个为信号肽,成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性,不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pT7ZZ表达质粒中,转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。     

人生长激素基因的cDNA克隆,原核高效表达及纯化

用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从含有全长人生长激素（ＨＧＨ）基因的ＣＨＯ细胞中获得ｈｇｈ的ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＥＴ－１１ｂ载体中,在大肠杆菌中获得高效表达,表达量占菌体蛋白总量的２０％。经色谱纯化后,纯度大于９５％。     

中性白细胞抑制因子在大肠杆菌中的表达与纯化

利用PCR技术扩增编码钩虫中性白细胞抑制因子(NIF)成熟肽的cDNA,克隆于表达载体pET-21a( )。序列分析表明与献报道一致。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中实现高效可溶性表达。SDS—PAGE分析结果表明,外源蛋白(相对分子质量28900)约占全菌蛋白的20％。菌体用溶菌酶处理。上清经Q—Sepharose FF阴离子交换、羟基磷灰石层析、Sephacryl S-100凝胶过滤,得到纯度约95％的重组NIF。活性测定结果表明,大肠杆菌表达的重组NIF能有效地抑制中性白细胞粘附。这些结果为利用大肠杆菌制备重组NIF奠定了基础。     

人内皮生长抑制素基因克隆表达及其抑瘤作用

内皮生长抑制素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是最近报道具有抑制肿瘤生长和铁蛋白质,为此,从正常人肝细胞株Ｌ０２中抽提总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获得了人内皮生长抑制素编码序列,序列分析表明,内皮生长抑制素ＣＤＮＡ开放阅读框架全长５５５ｂｐ,此基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为Ａ地８４０６０）,共编码１、８４个氨基酸残序列为５个碱基与文献报道不同,蛋白质序列中有３个氨基酸残基与文献报道不同,说明存在人种间差异。将人     

东亚钳蝎K+通道阻断肽cDNA的克隆与表达

目的：克隆东亚钳蝎毒素基因,以进一步研究其生物学和药理学功能。方法：利用已知蝎神经毒素基因序列,设计引物,用RT-PCR方法克隆从蝎毒腺组织蝎毒素cDNA。结果：成功地克隆了一个新的东亚钳蝎毒素基因,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中前22个为信号肽,成熟肽为37个氨基酸残基,经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTreHisA质粒中,在E．coli中表达了分子质量为7ku左右融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的21％左右。结论：其结构中含有三对二硫链,6个Cys残基组成蝎K^ 通道毒素共同特征序列-CXXXC-、-GXC-、-CXC-,推断其为K^ 通道阻断肽,命名为KChTX1。已被Gene-bank收录,收录号为AY129234。