中性白细胞抑制因子在大肠杆菌中的表达与纯化

利用PCR技术扩增编码钩虫中性白细胞抑制因子(NIF)成熟肽的cDNA,克隆于表达载体pET-21a( )。序列分析表明与献报道一致。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中实现高效可溶性表达。SDS—PAGE分析结果表明,外源蛋白(相对分子质量28900)约占全菌蛋白的20％。菌体用溶菌酶处理。上清经Q—Sepharose FF阴离子交换、羟基磷灰石层析、Sephacryl S-100凝胶过滤,得到纯度约95％的重组NIF。活性测定结果表明,大肠杆菌表达的重组NIF能有效地抑制中性白细胞粘附。这些结果为利用大肠杆菌制备重组NIF奠定了基础。     

含短C肽人胰岛素原类似物DesB30在毕赤酵母中的表达及纯化

合成含短C肽AAK,并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物:HMPIDesB30(human mini-proinsulin des B30)的cDNA,将其插入大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒pPIC9K.用电转移的方法将重组质粒HMPIDesB30/pPIC9K转入甲醇酵母GS115.用含不同G418浓度的YPD平板筛选高拷贝重组子.经优化条件下的高密度发酵,发酵液用SIPI-40大孔树脂吸附,大孔吸附树脂洗脱液经SP柱进一步纯化后,再用10～20 mmol/L Zn2 沉淀,能得到纯度为95%的HMPIDesB30.通过16.5%Tricine SDS-PAGE、HPLC和质谱分析,表达产物分子质量与理论分子质量相符,经高密度发酵,表达量可达1.0 g/L.纯化回收率可达60%.说明人胰岛素原类似物HMPIDesB30能在甲醇酵母中高效分泌表达,并能通过经济有效的方法纯化.     

含短C肽人胰岛素原类似物DesB30在毕赤酵母中的表达及纯化

合成含短C肽AAK,并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物：HMPIDesB³⁰ (human mini-proinsulin des B³⁰)的cDNA,将其插入大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒pPIC9K．用电转移的方法将重组质粒HMPIDesB³⁰/pPIC9K转入甲醇酵母GS115．用含不同G418浓度的YPD平板筛选高拷贝重组子．经优化条件下的高密度发酵,发酵液用SIPI-40大孔树脂吸附,大孔吸附树脂洗脱液经SP柱进一步纯化后,再用10～20 mmol/L Zn²⁺沉淀,能得到纯度为95%的HMPIDesB³⁰．通过16.5% Tricine SDS-PAGE、HPLC和质谱分析,表达产物分子质量与理论分子质量相符,经高密度发酵,表达量可达1.0 g/L．纯化回收率可达60%．说明人胰岛素原类似物HMPIDesB³⁰能在甲醇酵母中高效分泌表达,并能通过经济有效的方法纯化．