k-卡拉胶酶CgkX催化区的重组表达菌株筛选和发酵优化

目的：CgkX 是来自QY203 的一种高活性、高稳定性的k-卡拉胶酶，本文旨在构建CgkX 催化结构域 （CgkX-CM）重组表达菌株，并对发酵条件进行优化，提高CgkX-CM 的产量。方法：在分析k- 卡拉胶酶CgkX-CM基因序列的基 础上，构建多种CgkX-CM 表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行重组表达，通过酶活测定筛选其中产量最高的表达菌株，并 优化发酵起始pH、诱导温度、IPTG浓度、装液量以及甘氨酸浓度等因素。结果：构建了5 种重组表达菌株，其中BL21 (DE3)/pET22b-CgkX-CM 酶产量是其他重组菌株的7.4-11.6 倍。确定了该菌株最佳发酵条件为：培养基含1 g·L-1甘氨酸（起始 pH 7.5），装液量为75 mL，0.1 mmol·L-1 IPTG 20 ℃诱导28 h，酶产量是优化前的7.3 倍。结论：经过重组表达载体筛选和发酵优 化，CgkX-CM产量大幅度提高，为今后比较CgkX 全长及其催化区域的酶学性质，确定C 端Big_2 结构域对CgkX的作用奠定了 基础。     

黑曲霉α-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及表达

研究黑曲霉(Aspergillus niger)M-1菌株的α-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达。以M-1菌株的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增α-葡萄糖转苷酶的cDNA,重组到Trc启动子控制下的表达载体pSE380中,构建重组质粒pSE-αtg,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。初步研究表明:重组蛋白具有葡萄糖苷酶活性,最适pH为6.0,最适温度为45℃,金属离子Cu2 和Mn2 对酶活力有明显的促进作用。添加1.6mmol/L IPTG对重组菌的诱导作用最大,在培养中添加麦芽糖,对重组菌产酶有显著的促进作用。     

分散泛菌蔗糖异构酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了提高分散泛菌Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶产量,研究了不同信号肽及发酵条件对蔗糖异构酶在大肠杆菌中重组表达的影响。将携带天然信号肽的蔗糖异构酶基因优化后,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)构建重组表达菌株——ORI菌株,摇瓶发酵总酶活和胞外酶活分别为85 U/m L、65 U/m L。从天然信号肽开始第22位氨基酸作为成熟蛋白的起始,连接Pel B或Omp A信号肽构建P22和O22菌株,其中P22菌株发酵总酶活提高至138 U/m L,是ORI菌株总酶活的1.6倍;而O22菌株发酵总酶活和ORI菌株无明显差别。采用3.0 g/L的乳糖诱导,P22菌株的蔗糖异构酶总酶活提高至168 U/m L。在3 L发酵罐中,研究甘氨酸浓度和诱导时间对蔗糖异构酶分泌的影响,当补加0.5%甘氨酸,DCW为18 g/L(OD_(600)=30)开始诱导,P22菌株的蔗糖异构酶胞外酶活最高达1 981 U/m L,同时蔗糖异构酶总酶活达到2 640 U/m L,是已报道大肠杆菌重组表达蔗糖异构酶的最高水平。     

重组菌BL21-HTa-cgkZ产κ-卡拉胶酶的发酵条件优化

【目的】优化重组菌BL21-HTa-cgkZ产生κ-卡拉胶酶的发酵条件。【方法】通过单因子筛选和响应面分析方法对在IPTG诱导下的κ-卡拉胶酶的产生菌BL21-HTa-cgkZ进行产酶条件优化。【结果】该菌产酶的最佳培养基组成为：乳糖7 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,CaCl2 0.666 g/L。最佳诱导条件为：在工程菌接种1.55 h后添加IPTG,IPTG的浓度为0.89 mmol/L,诱导时间为24 h,诱导温度为23.03 °C。并确定了在培养基中添加乳糖、Triton X-100对κ-卡拉胶酶分布的影响。【结论】实验结果为产κ-卡拉胶酶工程菌的规模化生产奠定基础。     

4-羟基苯乙酸-3-羟化酶A重组表达菌株的构建及其对羟基酪醇的生物转化研究

目的:构建表达4-羟基苯乙酸-3-羟化酶A(4-hydroxyphenylacetate-3-hydroxylase A,HHA)的重组菌株,进而以酪醇为底物,利用重组菌株转化生产羟基酪醇。方法:选择大肠杆菌BL21(DE3)为模板来扩增HHA基因,经酶切后连接到表达载体p ET-28a中,获得重组表达载体p ET28a-HHA,将重组载体转化到感受态细胞BL21(DE3),在重组菌液中加入适量酪醇,利用胞内的重组酶对酪醇加羟基合成羟基酪醇,细胞离心后,分别采用薄层层析法和气质联用法检测上清液中羟基酪醇的转化结果。结果:IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE分析获得分子质量分别为58.8k Da和18.5k Da的两条蛋白质条带。薄层层析法和气质联用法均检测到催化产物羟基酪醇的生成。结论:成功构建了表达HHA的重组菌株,该菌株可有效将酪醇转化为羟基酪醇。     

鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR的方法从鼠李糖乳杆菌基因组DNA中扩增到D-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhD),并连接到载体pSE380上,构建表达质粒pSE-ldhD,将重组质粒pSE-ldhD转化大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明ldhD在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量约为37kD。同时采用紫外分光光度法测定D-乳酸脱氢酶的酶活,测得重组菌株的D-乳酸脱氢酶活力为5.4U/mL,最适反应温度为35℃,最适pH为5.6。     

嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及酶活性研究

旨为研究嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶的生化特性,以嗜酸喜温硫杆菌TST3的基因组DNA为模板,PCR扩增出硫加氧还原酶基因(sor),构建了表达载体p ET-sor,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(p ET-sor2)。SDS-PAGE实验证明,经IPTG诱导,该重组菌可以表达目的蛋白SOR。对诱导条件进行优化,并在最优的条件下诱导SOR酶表达,再经超声波破碎重组菌,上清液通过Ni+-NTA亲和层析柱纯化获得重组酶,其催化氧化反应的比酶活、Km值和Vmax分别为0.70U/mg,15.672×10-2 g/m L和12.755×10-5 mol/(L·min),而催化的还原反应的比酶活、Km值和Vmax分别为2.21 U/mg,0.507×10-2g/m L和4.876×10-5 mol/(L·min)。     

右旋糖酐蔗糖酶工程菌株的构建及其培养条件的研究

[目的]右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶.[方法]利用PCR扩增技术,将已获得的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG亚克隆到表达载体PET28a( )上,转化E.coli BL21(DE3),经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后,得到右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG.[结果]经IPTG诱导该基因在E.coli BL21(DE3)中能有效表达,在诱导过程中菌体生长受到抑制.通过对培养时间、IPTG浓度、培养温度、菌浓(OD600)和pH值等产酶因素的优化考察,得到最佳培养条件为:培养时间5h、IPTG浓度0.5mmol/L、25℃、OD600值1.0和pH6.0.酶活力由最初的5.39U/mL提高到35.62U/mL,其中pH值对产酶活力影响最大,在pH6.0时的最高产酶活力是LB原始pH条件下最高酶活的3.5倍,并且pH值也是导致在诱导后期酶活迅速下降的主要原因之一.[结论]酶的表达和酶活的研究结果表明,构建的工程菌株能够异源高效表达右旋糖酐蔗糖酶,并且表现出较高的酶活力.     

产普鲁兰酶重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

通过对产普鲁兰酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-s-pul菌株在发酵过程中质粒稳定性和普鲁兰酶生成量的考察,发现不同宿主对质粒稳定性及酶活性有重要影响。本文利用E.coli BL21(DE3)p Lys S菌株为宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)p Lys S/p ET28a-s-pul,通过控制外源蛋白的本底表达,提高了重组菌株的质粒稳定性。优化发酵培养基和发酵条件以后,重组菌产普鲁兰酶能力由480 U/m L提高至627 U/m L,增幅为30.6%。研究结果认为,严格控制外源蛋白的本底表达,是改善重组菌稳定性的重要方法之一。     

野葛糖基转移酶PIUGT2蛋白原核表达及其适宜条件探讨

通过单因素试验分别研究温度和IPTG浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pProEXHTa-PIUGT2诱导表达野葛糖基转移酶PlUGT2蛋白量的影响。利用150 ml LB液体培养基培养重组大肠杆菌BL21(DE3),并优化发酵条件。结果表明,在温度20℃和IPTG浓度为0.75 mmol/L条件下,PIUGT2蛋白表达量最高。     

重组大肠杆菌表达铜绿假单胞菌溶血性磷脂酶C

[目的]构建产溶血性磷脂酶C (Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli菌株,并初步优化其发酵条件.[方法]首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件.[结果]成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) /pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5％转接量,37℃、200 r/min下培养4h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL.[结论]本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础.     

一种来源于克劳氏芽孢杆菌的高碱性尿酸氧化酶的异源表达及重组酶性质分析

以碱性蛋白酶生产菌克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)基因组DNA为模板PCR扩增获得尿酸氧化酶基因(BcU),插入原核表达载体pET28α中,构建表达载体pET-BcU,并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-BcU。经IPTG诱导,重组菌BL21(DE3)/pET-BcU表达出有活性的尿酸氧化酶,含空质粒的重组菌在同样条件下没有酶活。酶学性质分析显示,重组酶最适pH值为9.0,在pH值9.0～11范围内酶活几乎不变,是一种高碱性尿酸氧化酶。     

β-蒎烯合成酶(QH6)在大肠杆菌中的表达及其产β-蒎烯的研究

蒎烯是一种重要的平台化合物,可以用来合成高密度燃料、精细化学品及材料。将来源于黄花蒿的β-蒎烯合成酶基因与外源杂合甲羟戊酸(MVA)途径一起整合到BL21(DE3)中共表达,通过气相色谱-质谱(GC-MS)和气相色谱(GC)对发酵产物进行了定性及定量检测。通过发酵条件优化,对影响发酵产β-蒎烯的因素(诱导温度、诱导剂浓度和N源)进行了考察。结果表明:来自黄花蒿的蒎烯合酶可以在宿主细胞内高效表达,且能高效催化β-蒎烯的合成。通过对重组菌进行发酵条件优化得到最佳培养条件:诱导温度为28℃,IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳有机N源为MD牛肉粉。在此条件下,检测出β-蒎烯产量达到22.89 mg/L,比优化前(4.60 mg/L)提高了3.98倍。     

神经菌毛素1 b结构域的克隆及表达

目的:制备重组人神经菌毛素1(NRP1)b结构域蛋白。方法:采用PCR技术,从p GEM-NRP1克隆载体中扩增人NRP1 b结构域(HuNRP1~b)cDNA,并将其克隆入pCold TF,构建重组原核表达质粒pCold-HuNRP1~b并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,制备重组大肠杆菌BL21(DE3)(pCold-HuNRP1~b),低温条件下用IPTG诱导重组菌的表达,制备重组蛋白TF-HuNRP1~b。结果:酶切、测序结果表明pCold-HuNRP1~b构建成功,经SDS-PAGE分析,重组质粒转化表达菌后重组蛋白TF-HuNRP1b获得表达,融合蛋白相对分子质量约90×10~3。结论:获得原核表达的重组HuNRP1~b蛋白,为该蛋白的规模化生产及其单克隆抗体的制备提供了有效的生物材料。     

Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶可溶性表达及产酶条件优化

【目的】克隆Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶的编码基因(alanine dehydrogenase),转化至Escherichia coli Rosetta(DE3)中构建可溶性表达alanine dehydrogenase(ald)的工程菌CZR07并优化产酶条件。【方法】提取A.ureafaciens CZ31菌株的全基因组DNA,设计引物扩增出ald基因,与pET-28a连接后导入E.coli Rosetta中表达并纯化重组蛋白,以单因素实验结果为依据,响应面法优化发酵条件。【结果】ald全长为1119 bp,编码含372个氨基酸残基的蛋白质,分子量约为40 kDa,酶活为2.65 U/mg。响应面分析温度、诱导时间及诱导剂浓度的影响强度为IPTG浓度温度温度×IPTG浓度温度×诱导时间IPTG浓度×诱导时间诱导时间。CZR07摇瓶发酵最佳条件为温度22°C、IPTG 0.7 mmol/L、诱导时间7 h,此条件下重组酶酶活达到15.23 U/mg,与响应面优化的预测值相似,较优化前提高5.75倍。【结论】克隆并实现了CZ31中ald基因的可溶性表达,采用BBD法优化产酶的诱导条件,获得显著的优化效果,为其他工程菌株产酶条件优化提供借鉴。     

琼胶酶AgaD在大肠杆菌中的高效表达

摘要:【目的】构建琼胶酶AgaD的高效表达体系,优化发酵条件提高重组酶的表达量。【方法】首先根据大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性,优化并合成AgaD的基因,使其适合E.coli表达系统;考察了不同的E.coli表达宿主;根据N端法则构建了突变体;评价了培养基中添加CaCl2和甘氨酸(Gly)对重组酶表达的影响。【结果】成功构建了琼胶酶AgaD 的高效表达体系,确定了E.coli AD494(DE3)为最适表达宿主;利用N端法则提高了重组酶的稳定性,缩短了发酵时间;通过在培养基中添加CaCl2和甘氨酸(Gly)进一步提高了胞外酶产量。最终,发酵上清中重组酶的活力由20 U/L提高至11300 U/L,比优化前提高了500余倍。【结论】构建了琼胶酶AgaD的高效表达体系,为GH96家族琼胶酶的深入研究奠定了基础。     

应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。     

趋磁菌AMB-1超氧化物歧化酶Fe-SOD在大肠杆菌中的表达及生理活性研究

超氧化物歧化酶(SOD)可以减轻超阳阴离子O2-对细胞的毒害作用,提高菌体的抗氧化能力,从而改善菌株的生理状态.利用PCR技术,将趋磁菌AMB-1的超氧化物歧化酶基因esod克隆至原核表达载体pET-20b(+),并在E coli BL21(DE3)有效表达.重组菌株BL21 (DE3)/(pET-20b-fesod-histag)在0.6 mmol/L IPTG诱导浓度下进行发酵培养,在生长前期2-14 h生长速率优于对照组E.coli BL21(DE3)/(pET-20b).通过亲和层析柱纯化后,重组酶蛋白纯度达电泳均一,超氧化物歧化酶fesod活性最造作用温度为25℃,在25℃和45℃下酶热稳定较好,pH4.2-8.2之间酶活力稳定.趋磁菌AMB-1来源的Fe-SOD作为一种抗氧化酶,在大肠杆菌中的有效表达从一定程度上改善了宿主菌的生长情况.     

链霉菌zxy19木聚糖酶酶学性质及酶基因克隆

采用平板筛选法,从红树林放线菌中筛选到一株有较强木聚糖酶活的菌株zxy19,其16SrDNA序列与Streptomyces sampsonii的同源性仅为96%.该菌株木聚糖酶活为852.41 IU/mL,酶反应最适pH值为7,最适反应温度为60℃.用针对木聚糖酶基因保守结构域的一对简并引物扩增到该酶基因部分序列,进而通过反向PCR扩增到了完整的酶基因,对该基因序列分析结果表明此木聚糖酶基因属于糖基水解酶家族11的成员,酶蛋白氨基酸序列与已报道序列同源性最高为79%(Streptomyces lividans xylanase B).构建了该酶重组表达质粒pET-28a-xyl 696,经过IPTG诱导实现了该酶蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源表达,且通过镍柱纯化后的表达产物具有生物学活性.     

苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B基因的克隆及表达

[目的]将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi B)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化。[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增Rpi B基因,经酶切连接表达载体p ET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况。通过LC-MS-MS验证重组酶活性。[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 k Da左右。优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多。重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19%。[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的Rpi B酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性。