人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

利用重叠PCR技术在体外拼接IFN β和HSA基因,将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNβ-HSA表明该蛋白分子量约为90kDa且具有HSA的抗原性;用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU/ml。     

双抗体夹心ELISA定量检测IFNβ-HSA融合蛋白方法的建立

为了建立β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)的酶联免疫定量分析方法,以抗IFNβ单克隆抗体为包被抗体,IFNβ-HSA融合蛋白为夹心抗原,辣根过氧化酶(HRP)标记抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法.并进行了检测限、精密度、准确度和稳定性等方法学考核.结果表明,包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为2μg/ml,抗原浓度在51.88-3320 ng/ml范围内呈良好线性关系,相关系数R2>0.99.检测限为10ng/m1.经方法学考核,批内、批间变异系数分别为4.86%和8.08%,回收率为91.9%～110.4%,与IFN-B、IFN-α、HSA、IFNα2b-HSA基本无交叉反应.健全性分析表明发酵液稀释倍数对该方法无影响,8 d连续检测标准曲线表明稳定性良好.这种定量检测IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法,灵敏度高,重复性好,为当前融合蛋白发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法,并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法.     

重组毕氏酵母中降解hIFNβ-HSA蛋白酶的鉴定及其活性控制

研究了重组毕赤酵母KM71／pPIC9K—IFNβ-HSA表达融合蛋白hIFNβ—HSA过程中产物降解的问题。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western—Blotting分析结果表明,发酵液中除了9．0×10^4的目的融合蛋白hIFNβ-HSA外,同时还出现了6．5×10^4的降解带,进一步结合HPLC分析证实该降解发生在融合蛋白hIFNβ—HSA的HSA区域。在此基础上,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）活性电泳的方法,确定在融合蛋白hIFNβ-HSA表达的过程中,引起融合蛋白hIFNβ-HSA降解的蛋白酶为蛋白酶B（Proteinase B,PrB）。最后,确定了可以抑制融合蛋白hIFNβ-HSA降解的最佳的蛋白酶抑制剂EDTA,通过在诱导表达阶段添加不同浓度的蛋白酶抑制剂EDTA,使融合蛋白的表达量达到22．18mg/mL,与空白对照组相比增加了61％。     

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）突变体（2Gly-hGLP-1）与人血清白蛋白（HSA）的融合蛋白。方法：为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸（Ala）定点突变为甘氨酸（Gly）,根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果：融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论：在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。     

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

人干扰素α2b和IgG Fc片段融合蛋白显著延长体内半衰期

重组人干扰素α(rHuIFNα)已被广泛用于临床治疗多种人类病毒性疾病和肿瘤。但IFNα在体内半衰期较短从而导致IFNα在用药后数小时即从血浆中被清除。目前常用化学修饰和构建融合蛋白的方法来延长IFNα的半衰期。在本研究中, 构建了IFNα2b与人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因(IFNα2b-Fcγ)并在毕赤酵母中以二聚体形式分泌表达, 并有部分糖基化。不同亚型Fcγ片段的融合蛋白对IFNα2b抗病毒活性均有一定影响。其中IFNα2b-Fcγ2所受影响最小, 较单纯的IFNα2b降低了2.3倍, 抗病毒活性可达4.29x107 IU/mg, 大鼠皮下注射后循环血液中半衰期达65 h, 血液中存留时间120 h以上, 比商品重组干扰素的体内半衰期延长约8倍, 血液存留时间延长10倍, 显示了其良好的临床应用 前景。     

人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达

干扰素α2b(interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒p MH3/HSA-IFNa2b,经电转的方法转入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/p MH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为65mg/L,进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养,不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异,获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株,3L摇瓶的流加培养结果显示,最佳发酵时间为15天,蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液,经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白,总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法,结果显示,CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达,表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。     

重组人r干扰素的纯化及其N端氨基酸序列分析

本文对两个重组人γ干扰素高效表达株pIFN-γ及PBVIFN-γ的表达产物进行了纯化并对纯化的γ干扰素进行了活性鉴定及N端氨基酸序列分析。采用连续沉淀的方法对高表达菌株pBVIFN-γ及低表达菌株pIFN-γ,裂解液进行初步纯化,然后应用单克隆抗体亲和层析方法进行纯化,分别可纯化14倍与933倍,均达电泳纯,回收率分别为25％和30％,比活性达7.56×10~7U/mg蛋白。SDS-PAGE电泳上γ干扰素分子量约17.5kD。测定了纯化的γ干扰素N末端19个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致,确认了本研究所表达、纯化的γ干扰素达到了较高纯度。本方法为γ干扰素的批量生产奠定了基础。     

人干扰素α—2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术,不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序,以及大肠杆菌表达的人干扰素α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题,从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得1000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为1×10~8u/mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

重组人干扰素βser17工程菌发酵培养条件的优化研究

实验对重组人干扰素βser17(rhIFNβser17)工程菌的发酵培养条件进行了研究,通过实验优化确定了适宜rhIFNβser17表达的培养基、诱导剂使用浓度、诱导时期和诱导后的收获时间等,建立了发酵培养工艺,并在50L发酵罐进行了中试发酵,菌体收获量湿重达13.08g/L,rhIFNβser17表达量占菌体总蛋白的20.2%,纯化后比活性达2×107IU/mg蛋白以上,为进一步的下游开发奠定了基础。     

人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达

为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期,构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达,工程菌经5L发酵罐培养后获得的含融合蛋白的培养液经超滤浓缩、蓝色葡聚糖凝胶层析、疏水柱层析以及阴离子柱层析,融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合,并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型,分别从静脉和皮下单剂量给药,给药浓度为90μg/kg时,在336h后血浆中仍可检测到融合蛋白。其静脉注射的血浆半衰期为101h,皮下注射的半衰期为68.2h。皮下注射的生物利用度为67.9%。IFNα2b与HSA融合后,明显的延长了血浆半衰期,显现了其良好的临床应用前景。     

融合蛋白Somatostatin-HSA不同串联体形式的表达及活性分析

目的:构建人生长抑素(somatostatin,SST)不同串联体形式与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,比较其在毕氏酵母中的表达情况以及生物活性高低。方法:PCR法扩增获得SST14和SST28的二联体和三联体基因,酶切连接形成与HSA的融和基因,并克隆到酵母表达载体pPIC9K中,电击转化毕氏酵母GS115进行高效表达。结果:4种融和蛋白在毕氏酵母中表达水平各不相同,其中(SST28)2-HSA的表达量最高,为200mg/L;(SST14)3-HSA的表达量最低,仅50mg/L;(SST14)2-HSA和(SST28)3-HSA产量居中。药效学分析发现与天然SST-14标准品相比,(SST14)2-HSA药效最佳且具有长效性。结论:融合蛋白(SST14)2-HSA有望弥补SST单体自身半衰期过短的不足,打开SST长效药物发展的新篇章。     

定量检测 IL-2-HSA 融合蛋白双抗体夹心 ELISA 法的建立

目的:通过抗体配对方法,建立能高特异、高灵敏地定量检测食蟹猴体内 IL-2-HSA 融合蛋白浓度的双抗体夹心 ELISA 法.方法:以 IL-2单克隆抗体为包被抗体、IL-2-HSA 融合蛋白为夹心抗、生物素标记的 HSA 为检测抗体,一抗和二抗的工作浓度分别为8μg/mL 和1∶5000,HRP 标记的亲和素为1∶200.结果:IL-2-HSA 融合蛋白标准品的曲线范围为3.9~250 ng/mL,最低检测限为3.9 ng/mL,与 IL-2、HSA、GLP-1/HSA 和 CD20单抗均无交叉反应,方法的回收率为98.9%~101.5%,批内和批间准确度分别为96.1%~98.3%和93.9%~105.4%.结论:本方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导则的要求,可用 IL-2-HSA 融合蛋白在临床前药代动力学试验的定量检测.     

III 型干扰素的抗肿瘤作用*

Ⅲ型干扰素(IFNλs)是干扰素家族中最新的一组成员。他们的很多生物学活性与临床上应用广泛的IFNα/β十分相似,但是他们所结合的受体与IFNα/β迥异。Ⅲ型干扰素的毒副作用显著小于IFNα/β,且抗肿瘤作用明显。本文回顾了近年来对Ⅲ型干扰素抗肿瘤功能研究的最新进展。     

重组人干扰素—β的中试研究

从大肠杆菌中大规模纯化新型干扰素β(IFN-βser17).首先建立IFN-βser17发酵和纯化工艺,连续大量纯化三批,并对纯化终产品进行全面鉴定.建立了稳定的发酵和纯化工艺流程,中试三批菌产量平均为4.33g/L,IFNβser17的表达量平均为20%,经破碎、粗提、精制后IFN-βser17的比活达2×107IU/mg以上,纯度超过96%,其他检定项目也均符合规程要求.     

人γ干扰素/β肿瘤坏死因子重组杂合蛋白对γ干扰素抗性细胞株的杀伤效应

已有大量研究资料表明,γ干扰素(Interferon γ,IFNγ)、淋巴毒素(Lymphotoxin,LT,又称TNFβ)或肿瘤坏死因子(TNFα),均有杀伤肿瘤细胞的细胞毒效应,并对其作用机理进行了广泛的研究。与此同时还对晚期肿瘤患者进行了临床治疗的探索,也取得了可喜的进展。但有些肿瘤细胞对这两种淋巴因子有天然的或逐渐获得的抗性现象,而且这两者在临床用有效抗癌剂量时,又可出现不同程度的副作用。为此有人用IFN和TNF联合处理肿瘤细胞,发现它们具有协同抗癌效应,这就为低剂量治疗肿瘤以减轻副作用提供了理论依据。据此,Feng等于1988年将人IFNγ和人TNFβ两个cDNA片段连接为融合基     

毕赤酵母高效分泌长效人生长激素的研究

目的:为了延长人生长激素(HGH)在血浆中的半衰期,构建了高效分泌表达人血清白蛋白(HSA)与HGH融合蛋白(HSA-HGH)的工程毕赤酵母菌株。方法:从人胎肝cDNA文库中扩增HSA基因,从HGH工程菌载体中扩增HGH基因,将其克隆至真核表达载体pHIL-D2,载体线性化后采用电击法转化毕赤酵母GS115。通过原位双层膜法筛选高效分泌表达菌株。分别采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定融合蛋白。对工程酵母培养条件进行研究,发酵液经离子交换层析、亲和层析和分子筛层析纯化。纯化的蛋白经N端序列测定,分子量测定和等电聚焦电泳进行鉴定。冻干的蛋白制剂经食蟹猴试验进行药代动力学和药效动力学测试。结果:确立了工程酵母的最佳培养工艺,融合蛋白表达量达100mg/L。纯化后蛋白纯度达95%以上,得率达42%。融合蛋白与预期结果一致,经食蟹猴试验,显示有良好的生物活性,与等摩尔剂量的重组人生长激素相比,半衰期延长6.8倍,清除率慢44倍。结论:融合蛋白呈现明显的长效动力学特征,为开发重组长效人生长激素HSA-HGH融合蛋白药物(rHSA-HGH)奠定了基础。     

重组人干扰素α2b的制备研究

为了获得高活性高纯度的rh IFNα2b,对重组人干扰素α2b进行克隆、表达,并深入研究了其纯化工艺。采用重叠延伸PCR法合成了编码IFNα2b的基因,用DNA重组技术构建了原核表达载体p BV220-IFNα2b,获得了稳定的工程菌种。发酵产物通过破菌、洗涤获得包涵体,再经过变性、复性、离子交换层析和凝胶过滤层析的纯化,得到rh IFNα2b纯品,其比活可达1×10~8IU/mg。实验结果为进一步开展临床前研究和长效制剂奠定了基础。     

人LL-37与干扰素α2a密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达

通过密码子优化,在毕赤酵母中高效表达人LL-37与IFN-α2a融合蛋白。先按P.pastoris密码子偏好性对LL-37与IFN-α2a的原始密码子进行了改造,并在二者之间加上Gly Gly Gly Gly Ser的柔性连接接头,人工合成设计的新序列,最后通过p PIC9K载体将其整合入P.pastoris GS115的基因组,构建出重组菌株GS115LI。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的GS115LI1和GS115LI2菌株。对这两株菌经发酵诱导后的发酵液进行SDS-PAGE检测、抗病毒活性检测和抗菌活性检测,证明重组株既能够成功表达出LL-37与IFN-α2a的融合蛋白,而且该融合蛋白成功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后,融合蛋白的产量可达到819.1 mg/L,经盐析、疏水层析和离子交换层析分离,可得到纯度达97%的融合蛋白产物,回收率可达到46.2%,纯化后产品的效价可达2.6×108 IU/mg。经过密码子优化后,成功实现在毕赤酵母中高效表达出既有LL-37抗菌活性又具有干扰素α2a活性的融合蛋白。     

缬沙坦改善小鼠动脉粥样硬化的作用机制研究

本研究通过给予动脉粥样硬化Apo E-/-小鼠不同剂量的缬沙坦(1 mg/kg,10 mg/kg),连续灌胃2周,观察其治疗效果,并分析正常饲养小鼠、动脉粥样硬化模型小鼠以及不同缬沙坦剂量组治疗小鼠干扰素系统蛋白和炎症反应蛋白水平的变化。研究表明,小鼠动脉粥样硬化管腔面积明显降低,斑块面积、血管内膜厚度及脂质中心面积明显升高,血清中干扰素(IFNα,IFNβ,IFNγ)、干扰素调节蛋白(IRF1,IRF2,IRF4,IRF8)、炎症反应因子(IL2,IL4,IL6,IL10,IL15)、质金属蛋白酶(MMP1,MMP9,TIMP1和TIMP3)等的表达水平均显著升高(p0.01),且与正常饲养小鼠、动脉粥样硬化模型小鼠相比有显著的统计学差异(p0.01),缬沙坦治疗后缬沙坦10 mg/kg组明显优于缬沙坦1 mg/kg组(p0.01)。因此,缬沙坦可能通过调控干扰素系统蛋白及炎症反应蛋白水平来改善小鼠动脉粥样硬化。此结果为探讨缬沙坦在改善动脉粥样硬化小鼠中的作用机制进一步深入研究提供理论依据,为临床治疗和新药开发提供参考方向。