人微小纤溶酶原基因在甲醇营养型酵母中的表达

用ＰＣＲ方法扩增人微小纤溶酶原（Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ,ｍｐｌｇ）ｃＤＮＡ,与分泌型酵母表达载体ｐＨＩＬＤ８重组,构成受醇氧化酶基因（ＡＯＸ１）的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,然后转化ＧＳ１１５酵母菌,经表型筛选、ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,然后以甲醇诱导表达,ｍｐｌｇ分泌至培液,以酪蛋白琼脂糖平板溶圈法、发色底物法检测,ｍｐｌｇ显示出纤溶活性。     

汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达

汉森酵母(H.polymorpha)是一类能以甲醇为唯一碳源和能源的甲基营养酵母,具有高表达外源基因、易于高密度发酵和产业化的特点。应用PCR技术扩增汉森酵母甲醇氧化酶(Methanol oxidase MOX)基因启动子和转录终止序列,并与汉森酵母Leu基因(Hpleu2)和人血管生成抑制素基因一起重组进大肠杆菌质粒pSP72,构建了整合型表达载体pSMA17,采用LiAc法将pSMA17转入汉森酵母A16(leu),筛选出阳性转化子H.polymorpha A16(pSMA17)。转化子在YPGE培养基中培养至对数生长后期,用甲醇进行诱导表达。ELISA和SDSPAGE分析结果证明人血管生成抑制素已获表达,表达产物分泌至培养基中。Western blot结果显示重组的人血管生成抑制素能与抗人纤溶酶原抗血清特异结合,具有免疫原性。     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut+表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

血管生成抑制因子K4K5 Cdna基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用PCR方法,扩增人纤溶酶原cDNA基因中K4K5 cDNA片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,获得表达质凿p9kkk-18。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,用G418－YPD筛选高拷贝表型,PCR筛选K4K5 cDNA与酵母染色体整全形成的阳性克隆,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达产物r-K4K5分子量约21.5kD,占分泌总蛋白80％以上,产物浓度为150－250mg/L。初步纯化产物抑制牛毛细血管内皮（BCE）细胞增殖与鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成。     

人可溶性低密度脂蛋白受体在甲醇酵母中的表达

为获得低密度脂蛋白受体配基结合结构域在甲醇酵母中的分泌表达 ,首先用RT PCR方法以人肝癌Bel 740 2总RNA为模板扩增了编码低密度脂蛋白受体配基结合结构域的基因片段。核酸测序分析表明克隆到的DNA片段的序列与报道的人LDLR的cDNA序列相同。然后构建了甲醇酵母表达质粒pPIC9K sLDLr ,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiapastorisGS115。分别用SDS PAGE、Westernblot和Ligandbindingblot对GS115 pPIC9K sLDLr上清中的重组sLDLR进行鉴定。SDS PAGE和Westernblot分析表明表达的sLDLR的表观分子量为 36kD。Ligandbindingblot分析表明表达的sLDLR具有配基结合的生物学活性     

利用degQ基因提高枯草芽孢杆菌纤溶酶表达*

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中通过PCR扩增得到degQ基因,将其克隆到含有枯草杆菌纤溶酶基因的蔗糖诱导表达载体pUBS中,并转化至B.subtillisDB403受体菌,得到基因工程菌DB403(pUBSD)。通过发酵表达证实degQ基因能增强枯草杆菌纤溶酶的表达,酶活提高了2.2倍。同时还对不同种类的糖、不同浓度蔗糖、不同诱导时间等发酵条件进行优化和比较研究。     

人纤溶蛋白酶原K5在毕赤酵母中的表达及其生物活性鉴定

化学合成人纤溶蛋白酶原K5 (pK5 )的编码基因并克隆到毕赤氏酵母表达系统的分泌型载体pPIC9K上 ,将重组质粒经BglⅡ单酶切后电转化PichiapastorisGS115菌株 ,筛选出对G4 18有高抗性和在MM培养基上生长缓慢的转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导后 ,用 15 %SDS PAGE检测发酵上清液 ,表明有重组蛋白pK5的高表达。经CM-Sepherose离子交换柱和Superdex 75分子筛层析两步分离纯化 ,获得了纯度达到 98%的rpK5。用MTT方法检测的结果表明 ,纯化的rpK5可显著地抑制人血管内皮细胞的生长     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白在酵母中的表达与活性检测

用PCR扩增SARS冠状病毒N蛋白全长cDNA,克隆到酵母表达载体pPIC3.5K,构建pPIC3.5K-SCoVN酵母表达质粒。表达质粒线性化后电转化到毕赤酵母GS115中,经G418-RDB, MM/MD平板与PCR扩增筛选获得His⁺ Mut⁺ 重组菌株。比较研究了不同的培养基、溶解氧以及甲醇浓度对菌株生长与重组蛋白表达的影响。结果表明：FBS培养基最适宜重组菌的生长与表达,溶氧对菌体的生长与表达有显著的影响,甲醇诱导最佳终浓度为1％（V/V）,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达量,发现重组N 蛋白表达量占细胞总蛋白的6％,每升培养基可以生产410mg重组N蛋白,生物量达45OD600。Western　blotting结果表明,重组N 蛋白对鼠源单克隆抗体以及SARS病人恢复期血清具有较强的特异性反应。对摇瓶培养条件进行了发酵罐放大实验,结果生物量达到348OD600,表达量达到 2.5g/L,分别为摇瓶表达的7.7倍和6.1倍,为SARS早期血清学诊断研究以及为N蛋白在病毒复制以及致病机理的研究奠定了一定的基础。     

人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体（HBscFv）。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因,亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中,线性化后转化P. pastorisGS115;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现,重组HBscFv可以在α因子的引导下,分泌至培养基中,产量为80mg/L;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性,活性总量在诱导培养72h后达最高峰,在诱导培养后期,HBscFv活性下降;PAS糖显色结果表明,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。     

人清道夫受体AII胞外部分在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

清道夫受体A (SR-A)介导巨噬细胞无限制摄取修饰的低密度脂蛋白 (Mldl)形成泡沫细胞 ,继而形成动脉粥样硬化病灶 ,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用 ,被认为是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。本文应用RT PCR方法扩增得到编码人Ⅱ型SR A胞外部分 (shSR AII)的Cdna ,将其克隆至毕赤酵母 (Pichiapastoris)分泌表达载体Ppic9k构建重组表达质粒P9k shSR AII。将重组表达质粒线性化后 ,电转化毕赤酵母GS115 ,用原位双膜法筛选获得高表达shSR AII的重组菌株GS115 P9k shSR AII。重组菌株经 1%甲醇诱导 ,SDS PAGE、Westernblot分析表明shSR AII获得了分泌表达。Ligandbindingblot结果表明表达的shSR AII具有与配基oxLDL结合的生物活性。U937泡沫细胞模型进一步表明shSR AII可通过竞争性结合oxLDL来抑制泡沫细胞的形成 ,为以shSR AII为靶点建立抗动脉粥样硬化药物筛选模型奠定了基础.     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．     

mdlA基因在毕赤酵母中的高效表达及表达产物性质研究*

将编码甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)的基因mdlA插入到分泌表达质粒pPIC9K中,通过电激将线性化的重组质粒整合到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,筛选出H is+Mut+表型菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,并用PCR方法鉴定。诱导培养后,SDS-PAGE表明MDGL在毕赤酵母中得到有效表达。表达产物在温度40℃,pH7.5具有最高活性,其发酵液酶活可达到325U/mL,以橄榄油为底物时没有检测到活性。表达产物与甘油三酰酯脂肪酶共同作用时产生的脂肪酸量比     

扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

将编码扩展青霉碱性脂肪酶（PEL）的cDNA克隆到酵母整合型质粒pPIC3.5K,电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过橄榄油MM平板及PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDSPAGE分析、橄榄油检验板鉴定,表明扩展青霉碱性脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中获得了高效表达。表达蛋白分泌至培养基中,分子量约28kD,与扩展青霉碱性脂肪酶大小一致,占分泌蛋白的95%。橄榄油检验板检验表明该表达蛋白可分解橄榄油,通过优化该表达菌的发酵条件,以橄榄油为底物进行酶活测定,其发酵液酶活可达260 u/mL。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在工业啤酒酵母中的整合和表达

用PCR合成的瑞氏木霉（T.reesei）β-内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）的cDNA, 构建了由酵母醇脱氢酶 （ADH1）启动子和终止子引导表达、β-内切葡聚糖酶自身信号肽序列引导分泌、由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIP型β-内切葡聚糖酶表达分泌质粒pA15PET。采用pA15PET与酵母YEP型G418抗性表达质粒的共转化,将EGⅠ表达单元整合到已整合有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）表达单元的啤酒酵母工程菌BE9711的染色体rDNA序列中,获得同时表达胞内α-ALDC和胞外β-内切葡聚糖酶的啤酒酵母工程菌。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

人纤溶酶原K1-3基因的克隆、表达和产物的纯化及抗癌活性分析

纤溶酶原K13功能区是近年发现的血管生成抑制因子,具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素cDNA为模板用PCR技术扩增了K13功能区的基因,DNA序列分析后克隆至质粒pPIC9K上获得重组质粒pPIC9K13,转化毕节酵母GS115,用PCR和G418法筛选高拷贝转化子,进行摇瓶发酵。SDSPAGE和Western blot分析结果证实K13基因已在GS115分泌表达,并具有免疫活性。选用30L和80L罐进行高密度发酵,甲醇诱导48h细胞密度达到OD250～300,比摇瓶提高5～6倍,表达量150200mg/L。发酵上清液经Streamline SP离子交换及PhenylSephorose疏水层析纯化,在SDSPAGE上显示一条带,纯度96%,动物实验证明纯化产物具有抗血管生成和抗肿瘤的活性。      

用P.pastoris表达L-阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析

目的:用毕赤酵母表达L-阿拉伯糖异构酶。方法:用PCR法扩增大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因,构建含L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-ai。通过电转法将pPIC9K-ai转化毕赤酵母GS115基因组。先筛选出高G418抗性的克隆,然后再从高拷贝的克隆中筛选出高表达重组L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-ai)。结果:在甲醇诱导下,摇瓶发酵GS115(pPIC9K-ai)3d,分泌表达L-阿拉伯糖异构酶32 mg/L。结论:毕赤酵母表达的L-阿拉伯糖异构酶具有转化D-半乳糖为D-塔格糖的生物活性。每升GS115(pPIC9K-ai)发酵液能转化D-半乳糖生成30 mgD-塔格糖。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达

以海栖热袍菌 (Thermotoga maritima) MSB8菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出木聚糖酶（XylanaseB）基因, 将此基因克隆至大肠杆菌表达载体pET_28a（+）和毕赤酵母表达载体pPIC9K,并分别转化大肠杆菌 BL21和毕赤酵母GS115。该木聚糖酶在大肠杆菌细胞中表达量高, 但不能分泌; 而在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。酶学性质分析表明,此酶分子量约为40kD,其最适反应温度为90℃, 最适反应pH值为6.65,且在碱性条件下稳定,具有重要的工业应用前景。     

人防御素6基因的克隆、亚克隆及在酵母中的分泌表达

探讨人防御素6(HD-6)在毕赤酵母中表达的可行性,为进一步研究HD6的功能提供理论依据和实验基础。采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与毕赤酵母表达载体pPICZαA重组,以得到重组的HD-6酵母表达载体pPICZαA/HD-6,并进行琼脂糖电泳和测序鉴定。再将构建好的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA/HD-6经SacⅠ线性化后,应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态中,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDSPAGE分析重组HD-6的表达。从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和测序结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内;线性化的重组质粒pPICZαA/HD-6成功转化进入毕赤酵母感受态中,PCR鉴定结果与预期相符;蛋白电泳证实重组HD-6在酵母中获得分泌表达。提示重组HD-6可以在毕赤酵母中实现分泌表达。