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为了降低野生型葡激酶 (wild- type staphylokinase,wt- Sak)的免疫原性 ,对已构建的葡激酶N端缺失突变体 (ΔNSak) c DNA进行改造 ,将其主要的抗原决定簇编码序列突变为丙氨酸密码子 .该突变体 (ΔNMSak) c DNA与原核表达载体 p LY- 4重组后 ,转化大肠杆菌 JF1 1 2 5.经温度诱导 ,ΔNMSak获得高效表达 ,重组蛋白占全菌总蛋白的 60 % ,以包涵体形式存在 .包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离至电泳纯 ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 8.5× 1 0 4 HU/mg.经 ELISA法、发色底物法测定 ,ΔNMSak与 wt- Sak制备的兔抗wt- Sak抗血清的免疫反应性显著降低 ,经抗血清温育后 ,wt- Sak活性下降程度远高于 ΔNMSak.ΔNMSak、wt- Sak分别免疫豚鼠 ,以 ELISA法测定豚鼠血清中相应抗体的效价 ,ΔNMSak组的抗体效价明显低于 wt- Sak组 ,表明 ΔNMSak的免疫原性显著下降 . 相似文献
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人微小纤溶酶原基因在甲醇营养型酵母中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
用PCR方法扩增人微小纤溶酶原(Microplasminogen,mplg)cDNA,与分泌型酵母表达载体pHILD8重组,构成受醇氧化酶基因(AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,然后转化GS115酵母菌,经表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆,然后以甲醇诱导表达,mplg分泌至培液,以酪蛋白琼脂糖平板溶圈法、发色底物法检测,mplg显示出纤溶活性。 相似文献
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同源模建人微小纤溶酶原(microplasminogen ,mplg)的三维结构,建立葡激酶(staphylokinase,Sak),mplg计算机分子对接的结构模型,模型与已有的实验结果基本相符。为研究葡激酶N端结构与功能的关系,进一步改造葡激酶分子,根据复合物结构模型设计了N端缺失15个氨基酸的葡激酶突变体。 相似文献
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重组人纤溶酶原基因的酵母表达、产物纯化及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的: 研究重组人纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域(rhPLG-SP)的酵母表达、纯化及理化性质。 方法:采用7.5 L发酵罐对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌 rhPLG-SP/GS115 进行高密度培养、甲醇诱导表达rhPLG-SP,培养液经三步纯化:超滤、Sephacryl S-100、SP-Sepharose FF,将活性组分透析后冷冻干燥。等点聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测 rhPLG-SP等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S-2403 分别测定 rhPLG-SP激活后的纤维蛋白溶解和酰胺水解活性。结果: 7.5 L高密度发酵可获得约为400mg/L培液的表达量,经三步纯化后制备的rhPLG-SP纯度大于96%。理化分析显示 rhPLG-SP的等电点为7.5~7.8,分子量:27 877 Da,比活性:23.6U/mg。结论: 初步建立了rhPLG-SP酵母工程菌的高密度培养、表达及纯化工艺,所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近,具备放大生产和应用的潜力。 相似文献
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人纤溶酶原结构和功能研究进展 总被引:2,自引:0,他引:2
宋钢 《国外医学:分子生物学分册》1999,21(1):39-42
人纤溶酶原是纤溶系统的主要成分,与体内多种生理,病理过程密切相关。本文综述Plg基因及其编码的蛋白质的结构与功能,由此进一步阐述其临床意义。 相似文献
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为了降低野生型葡激酶 (wild- type staphylokinase,wt- Sak)的免疫原性 ,对已构建的葡激酶N端缺失突变体 (ΔNSak) c DNA进行改造 ,将其主要的抗原决定簇编码序列突变为丙氨酸密码子 .该突变体 (ΔNMSak) c DNA与原核表达载体 p LY- 4重组后 ,转化大肠杆菌 JF1 1 2 5.经温度诱导 ,ΔNMSak获得高效表达 ,重组蛋白占全菌总蛋白的 60 % ,以包涵体形式存在 .包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离至电泳纯 ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 8.5× 1 0 4 HU/mg.经 ELISA法、发色底物法测定 ,ΔNMSak与 wt- Sak制备的兔抗wt- Sak抗血清的免疫反应性显著降低 ,经抗血清温育后 ,wt- Sak活性下降程度远高于 ΔNMSak.ΔNMSak、wt- Sak分别免疫豚鼠 ,以 ELISA法测定豚鼠血清中相应抗体的效价 ,ΔNMSak组的抗体效价明显低于 wt- Sak组 ,表明 ΔNMSak的免疫原性显著下降 . 相似文献
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用PCR方法扩增人微小纤溶酶原(Microplasminogen,mplg)cDNA,与分泌型酵母表达载体pHIL-D8重组,构成受醇氧化酶基因(AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,然后转化GS115酵母菌,经表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆,然后以甲醇诱导表达,mplg分泌至培液,以酪蛋白-琼脂糖平板溶圈法、发色底物法检测,mplg显示出纤溶活性。 相似文献
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