FAD依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

通过体外多拷贝构建实现FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)在毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株中的高效表达。将前期构建的经密码子偏好性优化FAD-GDH基因插入到pPICZαA质粒中，通过同尾酶法酶切酶连构建含1～4个表达盒的重组表达质粒，分别电转至毕赤酵母X33中，成功筛选到各种重组菌株。qRT-PCR测定结果表明，载体所含的表达盒数目与嵌合进毕赤酵母基因组中的GDH基因拷贝数之间存在正相关关系。重组菌在试管水平用甲醇诱导72 h,酶活达到最高，其中4拷贝的转化子表达水平最高；选择1拷贝和4拷贝转化子进行10 L发酵罐扩大培养，1拷贝菌株诱导108 h酶活达到最高697.125 U/mL,4拷贝菌株诱导132 h酶活达到最高1 063.279 U/mL,比1拷贝酶活提高52.52%。结果表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD-GDH的表达量，为其进一步扩大生产提供参考。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ（EGⅣ）在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中的表达。采用RT—PCR的方法从里氏木霉（Trichoderma reesei）中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris—EGⅣ1。在甲醇诱导下,重组菌株P.pastoris-EGⅣ1可以合成并分泌EGⅣ,培养液的CMC活力达到2．11U／mL。     

神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达

根据人神经营养素3（Human neurotrohin3,hNT3）的基因序列,把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母（Pichia pastoris）偏爱的形式,设计了10条36～59nt的寡聚核苷酸引物,通过5次连续PCR反应,获得了人工合成的NT3 cDNA片段（简称NT3b基因）。将合成的NT3b基因克隆到pPIC9K质粒上,获得重组表达载体pPIC9KNT3b。将重组表达载体pPIC9KNT3b和pPIC9KhNT3分别电击转化宿主毕赤酵母GS115菌株,经筛选得到重组转化子。不同转化子经甲醇诱导,表达产物进行SDSPAGE检测、Western blot检测和ELISA分析,结果表明,NT3b基因和hNT3基因成功获得分泌性表达,从整体水平上,使用偏爱密码子的NT3b基因在毕赤酵母GS115菌株中的表达明显优越于hNT3基因(x2=4.334,P<0.05),表达量在诱导后72～96h最高,达到31mg/L左右。     

里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用外显子拼接的方法,以里氏木霉Trichoderma reesei基因组 DNA 为模板,克隆出内切-1,4-β-D-葡聚糖酶II基因egl2的全编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pQY2025。重组质粒线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达内切葡聚糖酶II的毕赤酵母工程菌株Gp2025。用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,培养基中内切葡聚糖酶II的活力可达1573.0U/mL,同时对重组内切葡聚糖酶II的性质进行了初步研究。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达

【目的】实现黑曲霉来源的阿魏酸酯酶在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的组成型表达。【方法】以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),将其与载体pGAP9K相连,构建重组表达载体p GAP9KAnfae A,经SalI线性化后电转入毕赤酵母GS115中,得到重组菌株。高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶活力,并对重组菌进行了发酵优化。【结果】克隆得到783 bp的阿魏酸酯酶编码基因并实现了其在毕赤酵母中的组成型表达。重组菌发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10 U/m L。重组酶(reAnfaeA)经分离纯化后比酶活为59.75 U/mg,大小约为40 k D。发酵优化结果为:葡萄糖40.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母膏30.0 g/L,CaCO_3 0.2 g/L,种龄28 h,接种量3%(体积比),装液量50 m L/250 m L。在此条件下发酵培养,酶活达15.60±0.23 U/m L。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达,对研究毕赤酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。     

理性设计和基因剂量效应提高米根霉脂肪酶ROL的表达水平

[目的]实现米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶ROL在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达,为其产业化奠定基础。[方法]通过基因的理性设计提高其在毕赤酵母中的表达水平,再通过构建含串联的ROL基因的表达载体,获得含多拷贝ROL基因的重组菌株,拟通过提高ROL基因在宿主细胞中的基因剂量来进一步提高其表达量。[结果]基因的理性设计和基因剂量有效地提高了ROL基因在毕赤酵母中的表达量。原始ROL基因重组表达菌株活性最高的为260 U/mL。进行密码子优化后,发酵罐条件下,其活性最高的为26 500 U/mL,前后相比较,酶活力提高10倍。[结论]成功获得了脂肪酶ROL高效表达的菌株,完成了在小型发酵罐中的产酶能力评估,为该酶的工业化生产奠定了基础。     

里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达

内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足,通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体p PIC9K-eg2,并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子,利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115-EGⅡ。重组酶的酶学性质分析显示,该酶分子量50 k Da、最适p H(p H 4.5)略有降低及最适反应温度为60℃,专一性地作用于非结晶纤维素,与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化,该菌摇瓶培养条件:培养温度28℃、起始p H 5.0、接种量2%、每24 h添加甲醇1.5%(V/V)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4 g/L,发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/m L。进一步上罐(5 L)发酵180 h,该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/m L,蛋白含量达到4.16 g/L。重组毕赤酵母P.pastoris GS115-EGⅡ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌,该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因（BGL1）,长度为2596 bp,连接到pGEM-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框,构建成重组质粒pSHL9K.通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株.重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4.培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL.     

Cloning of the nitrile hydratase gene from Nocardia sp. in Escherichia coli and Pichia pastoris and its functional expression using site-directed mutagenesis

To obtain a recombinant Rhodococcus or Nocardia with not only higher enzymatic activity but also better operational stability and product-tolerance ability for bioconversion of acrylamide from acrylonitrile, an active and stable expression system of nitrile hydratase (NHase) was tried to construct as the technical platform of genetic manipulations. Two NHase genes, NHBA and NHBAX, from Nocardia YS-2002 were successfully cloned, based on bioinformatics design of PCR primers, and inserted into plasmid pUC18 and pET32a, respectively. Then, two recombinant Escherichia coli strains, JM105 (pUC18-NHBA) and BL21 (DE3) (pET32a-NHBAX) were constructed and their expressions of NHase were focused. The induction results showed that there was either no NHase activity in JM105 (pUC18-NHBA), or as low as 0.04 U (1 U=1 μmol acrylamide min⁻¹ mg⁻¹ dry cell) in BL21 (DE3) (pET32a-NHBAX). SDS-PAGE results showed that the -subunit of NHBA and NHBAX could not be efficiently expressed in both recombinant E. coli strains. The novel Pichia pastoris system was also applied to express NHase, but the expression level remained quite low (0.5–0.6 U) and the protein was unstable. For solving this problem, a possible genetic strategy, site-directed mutagenesis of the -subunit of the NHase was carried out. After the successful mutagenesis of the original rare start codon gtg into atg, a new recombinant strain, E. coli XL1-Blue (pUC18-NHBA^M), was screened and the NHase activity stably reached as high as 51 U under the same induction conditions.     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

利用温控载体构建碱性果胶酯裂解酶工程菌

从筛选出的Bacillus subtilisWSHB04-02菌株中扩增出编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入载体pET22b( )多克隆位点,得到带有前导序列PelB重组质粒pET22b( )PL。以pET22b( )PL为模板扩增出带前导序列的碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入温控载体pHsh,重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。其表达量与以T7为启动子的重组菌BL21DE3[(pET22b( )PL]相比,表达量相近。SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量均为43kDa,同核酸序列测定所推导的值相符。研究表明利用pHsh构建的JM109(pHsh PL)诱导表达好,诱导方式简单廉价,这对该酶的大规模发酵具有重要意义。     

海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶基因xynB64在大肠杆菌中的融合表达

来源于极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima MSB8)的木聚糖酶B具有极高的热稳定性,在饲料、造纸、能源和食品医药行业具有巨大应用潜力。携带酶基因xynB64的pET28a(+)重组载体在宿主大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,重组酶活力较低。更换宿主为携带稀有tRNA基因的大肠杆菌:BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL和Rosetta(DE3)后,酶活力分别提高了197%和277%,但是后者中的表达会形成部分包涵体。宿主菌为大肠杆菌Rosetta(DE3),更换载体为4种融合表达载体pET32a(+)、pET42a(+)、pET43.1a(+)和pMAL-c2X进行表达,重组酶分别融合了Trx、GST、Nus和MBP标签。其中Rosetta(DE3)/pMAL-c2X-xynB64表达酶活力最高,相当于Rosetta(DE3)/pET28a-xynB64表达酶的88%,而且目的酶表达量占全细胞蛋白的40%,几乎不形成包涵体。     

产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究

成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNH^M(Kan^r),研究了重组质粒pETNH^M在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNH^M具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNH^M具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNH^M以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。     

果胶裂解酶基因PelC表达载体的构建及原核表达分析

从实验室分离保存的1株产果胶酶的菌株（BTC105）中克隆果胶裂解酶基因（PelC）完整开放阅读框,通过载体构建,将目的基因连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希茵BL21（DE3）进行融合表达,在LB（Luria—Bertani）中进行摇瓶发酵,1mmol／LIPTG（异丙基－β－D－硫代半乳糖苷）诱导。结果表明,拘建了表达载俸pET28a－felC,果胶裂解酶主要在胞内表达,酶活最适pH为5．4,最适温度为50℃,Ca^2＋对酶活促进作用最为明显,Cu^2＋完全抑制了酶的活性。     

SARS冠状病毒S蛋白结构预测及表达初探

利用生物信息学的工具和方法,对SARS病毒基因组中预测的S蛋白（spike protein）的编码序列进行了分析,预测了其结构特征和可能的功能域。选择其中最有可能参与受体识别及产生主要免疫原性的区域(S401～659)作为待表达区域。将通过PCR获得的此段S蛋白片段的编码序列克隆至大肠杆菌载体pET28a(+)和酵母表达载体pPIC9K中,分别构建了pET28a(+)-S和pPIC9K-S表达质粒,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)-star和毕赤酵母中表达。产物的蛋白电泳和蛋白印记结果表明,S蛋白片段获得成功表达。采用镍离子螯合层析法纯化变性的包涵体样品,纯度达90%以上。     

Comparison of expression of monomeric and multimeric adenoregulin genes in Escherichia coli and Pichia pastorias

Adenoregulin is a 33 amino acid antibiotic peptide who belongs to dermaseptin family which is the first vertebrate family to show lethal effects against filamentous fungi, as well as a broad spectrum of pathogenic microorganisms. Synthetic adenoregulin gene was cloned in 2, 4 and 6 tandem repeats and subcloned in pET32a and pET22b vectors. Recombinant plasmids were transformed into E. coli BL21(DE3), Fusion proteins of Trx-ADR1, Trx-ADR2 and Trx-ADR4 could be expressed after the hosts were induced by IPTG, but the expression level decreased dramatically with the number of tandem repeats increased. ADR1, ADR4 and ADR6 could not be expressed by E. coli without carrier proteins. But for Pichia pastoris GS115, ADR1 and ADR6 in the fermentation broth of the hosts could be detected by ELISA, and the bactericidal activities could also be observed.