丙型肝炎病毒基因组C区和NS3区基因cDNA的融合及其在大肠杆菌中的表达与初步应用

通过逆转录（ＲＴ）－聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从中国人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）携带者的血清中扩增并克隆到２段ｃＤＮＡ片段,即ＨＣＶ基因组Ｃ区抗原基因Ｃ８３１ｃＤＮＡ片断（约５３０ｂｐ）和ＮＳ３区抗原基因Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段（约８６０ｂｐ）。Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段同Ｃ８３１ｃＤＮＡ片段经连接　　　肽Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ连接成为基因嵌合体Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１（约１４００ｂｐ）。Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１基因嵌合体同温控型原核表达载体ｐＢＶ２２０重组,构建成表达质粒ｐＢＶ／Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１,并在大肠杆菌细胞中获得了重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ的表达。通过酶切分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法,对约占菌体可溶性蛋白９％的表达产物做了鉴定。采用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和盐析处理,获得粗提表达产物。粗提的表达产物经尿素裂解和离子交换层析纯化,得到可用于检测抗ＨＣＶ核壳蛋白和抗ＮＳ３区抗体的重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ。对Ｃ３３ｃ－ＣＬ做抗原性分析发现,它同时具有完整的Ｃ３３ｃ抗原和Ｃ２２抗原的免疫反应活性,完全能替代单纯的Ｃ３３ｃ和Ｃ２２抗原。该嵌合抗原在血清学诊断中有重要的应用价值,可望成为新一代ＨＣＶＥＩＡ诊断试剂的优选抗原。     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．     

丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究

用ＰＣＲ 方法从丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） ｃＤＮＡ 文库中克隆了两段ＤＮＡ 片段,即ＨＣＶ 基因组非结构ＮＳ３区抗原基因（约０．７ ｋｂ）和核心抗原Ｃ区抗原基因（约０．６ ｋｂ）的ｃＤＮＡ 片段。在两段ｃＤＮＡ 间加入连接肽Ｓｅｒ－ Ｐｒｏ－ Ｇｌｙ－ Ｓｅｒ 的密码子序列,构建成融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ。将该融合基因与衣藻叶绿体基因ａｔｐＡ 的启动子和ｒｂｃＬ 基因的３′末端连接,得到丙肝病毒融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ表达盒,再将该表达盒与选择标记基因ａａｄＡ 表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接,构建成衣藻叶绿体转化载体ｐＳＳ６。基因枪法转化衣藻叶绿体,经壮观霉素筛选获得转化再生的单藻落,对转基因衣藻的ＰＣＲ 和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析表明,融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ已整合到衣藻叶绿体基因组中。     

抗肿瘤血管三结构域单链抗体ＶＨ／Ｌ的构建与表达

以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆体ＡＡ９８为基础,采用ＰＣＲ扩增抗体ＡＡ９８基因的重链可变区（ＶＨ）和轻链（Ｌ）,以重链恒定区１（ＣＨ１）５′端１２个氨基酸的序列作为连接肽,并将连接肽中的Ｌys变为Ｓer,构建ＶＨ－连接肽－Ｌ三结构域单链抗体。重组ＶＨ／Ｌ单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占菌体总蛋白质的２０％。,表达的蛋白质在菌内形成包含体,经凝胶过滤法复性,获得了有抗原结合活性的ＶＨ／Ｌ。该三结构域单链抗体的成功构建和复性,为重组抗体片段的研制提供了借鉴。     

新型HCV EIA诊断试剂盒的研制

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组结构区核壳蛋白（Ｃ）区抗原、膜蛋白Ｅ１和Ｅ２区抗原,以及非结构区ＮＳ３－ＮＳ５区抗原的区段,已经在原核细胞中获得有效的表达。同时,相应区段中的优势抗原表位肽也经化学合成法大规模地制备。ＨＣＶ基因组上各区段抗原性的分析发现,由Ｃ区和ＮＳ３区分别编码的Ｃ抗原和Ｃ３３ｃ抗原是ＨＣＶ基因组上两个优势抗原区段。其相应的抗体出现早（感染后６周可检出抗Ｃ３３ｃ抗体）,阳转率高（约９９％阳性检出率）,特异性和重复性均优于其它区段抗原。以中国人ＨＣＶ的Ｃ３３ｃ重组蛋白和分支状合成肽ＭＡＰ－Ｃ－１９为复合抗原,研制了适合我国抗ＨＣＶ抗体检测的新型丙型肝炎病毒酶免疫测定（ＨＣＶＥＬＡ）诊断试剂盒。它同当代美国Ａｂｂｏｔｔ／ＵＢＩＨＣＶＥＬＡ诊断试剂的符合率约９８％,同加拿大ＹＥＳ公司ＨＣＶＥＩＡ诊断试剂的符合率约９７．８％,阳性检出率提高了约２％,３次重复性达１００％,表明其特异性、敏感性和重复性均达到了当代第二代ＪＣＶＥＬＡ诊断试剂的水平。我国人群中抗ＨＣＶ抗体的分布情况为：正常人群的检出率１％－２％;外科类住院病人检出率约２８．８％;肝炎患者抗ＨＣＶ阳性率为３４．４％,慢活肝、肝硬化和重症肝炎患者     

抗人黑色素瘤单链抗体基因的克隆和分泌型表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从分泌抗人黑色素瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＢ８７６０中克隆了抗体轻、重链可变区基因,然后用（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３连接肽基因将ＶＨ、ＶＬ连接成ＳｃＦｖ基因,并进行了序列测定．计算机分析表明ＶＨ,ＶＬ均符合小鼠抗体可变区的特征,为功能性重排的抗体可变区基因．ＶＨ、ＶＬ、ｌｉｎｋｅｒ拼接正确．ＳｃＦｖ基因全长７２９ｂｐ,其中ＶＨ基因长３６０ｂｐ,编码１２０个氨基酸,ＶＬ基因长３２４ｂｐ,编码１０８个氨基酸．在噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中表达了可溶性的ＳｃＦｖ蛋白,表达产物经流式细胞仪检测可特异地与黑色素瘤细胞结合,不与肝癌、胃癌及良性黑痣细胞结合     

Ⅲ型中国株HCVE2/NS1基因与已知分离株的同源性比较

利用逆转录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株ＨＣＶＥ２／ＮＳ１基因片段,将其克隆到ｐｃＤＮＡ３载体上．采用双脱氧链终止法测定插入片段的核苷酸序列．并与已知分离株的相应区域进行同源性比较．首次克隆出Ⅲ型中国株ＨＣＶＥ２／ＮＳ１基因（ＨＣ－Ｗ１４）,其核苷酸序列与Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６）该区域同源性为８８．３７％,其推定的氨基酸同源性为８９．２９％．而与已知的非Ⅲ型株ＨＣＶ该区域相比,核苷酸及氨基酸的同源性均相对较低．Ⅲ型中国株ＨＣＶ与Ⅱ型中国株ＨＣＶ在Ｅ２／ＮＳ１区域有较大的变异,揭示研制我国的ＨＣＶ疫苗应该考虑这种基因型之间的变异性．     

丙型肝炎病毒基因组C区和NS3区基因cDNA的融合及其在大肠杆菌中的…

通过逆转录－聚合酶链式反应,从中国人丙型肝炎病毒携带者的血清中扩增并克隆到２段ｃＤＮＡ片段,即ＨＣＶ基因组Ｃ区抗原基因Ｃ８３１ｃＤＮＡ片断和ＮＳ３区抗原基因Ｃ３３ｃＤＮＡ片段同Ｃ８３１ｃＤＮＡ片段经连接肽Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ连接成为基因嵌合体Ｃ３３ｃＤＮＡ片段同Ｃ８３１ｃＤＮＡ片段经连接肽Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ连接成为基因嵌合体Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１．Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１基因嵌合体同温     

两个猪瘟病毒野毒株gp55基因抗原编码序列的分析及比较

利用反转录－ＰＣＲ方法扩增了吉林省猪瘟病毒（ＨＣＶ）两个野毒株ｇｐ５５基因的主要保护性抗原编码区,并将其克隆到ＰＧＥＭ＿Ｔ载体中,然后用Ｓａｎｇｅｒ双地测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序徇。将测定的这两个ＨＣＶ野毒株的部分序更与国内外已知的ＨＣＶ序列进行比较,结果表明：这两个野毒株的核苷酸序理的同生为９４．９％,氨基酸序列同源性为９７．４％,与１９８５－１９９２年意大利中部分离４个野毒的同源性     

人精子膜蛋白片段在沙门氏菌中的表达——一种制备抗生育疫苗的途径

合成编码一种人精子膜蛋白ＹＷＫ－Ⅱ胞外区的一段多肽片段的双链寡核苷酸链,ＨＳＤ－２ａ。用平端连接的方法将其插入到沙门氏菌鞭毛基因ｆｌｉＣ（ｄ）的抗原表位ＩＶ高变区ＥｃｏＲＶ位点,构建了重组质粒ｐＬＳ４０８－Ｈ１。重组基因在鞭毛负性ａｒｏＡ基因缺失的无致病性沙门氏菌Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ ＳＬ５９２８疫苗菌株中表达。经ＥＬＩＳＡ、电镜免疫胶体金法检测,表明ＨＳＤ－２ａ编码的多肽片段成功地在沙门氏菌鞭毛表面     

HCV核心抗原基因的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ抗原部分基因片段,将其克隆到一种新的表达载体ＰＱＥ中构成重组质粒ＰＱＥ－Ｃｏｒｅ短,转化大肠杆菌Ｍ１５株。含ＰＱＥ－Ｃｏｒｅ重组质粒的工程菌株以２ＹＴ中３７℃下培养加入ＩＰＴＧ诱导７小时,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳分离蛋白质,证明工程菌合成了大量改造的ＨＣＶ Ｃｏｒｅｎｈｊ ｒ     

丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用

选取丙型肝炎病毒(HCV)核壳蛋白区两个可能含有优势抗原表位的19和16氨基酸的肽殴(C-19肽和C-16肽),利用固相多肽合成技术进行了化学合成。经用反相高压液相层析(HPLC)及脉冲液相多肽测序技术检定合成肽产品的纯度及序列后,以C-19和C-16肽作为包被抗原组装成检测HCV血清抗体的ELISA诊断试剂。用所组装的合成肽试剂检测中国药品生物制品检定所提供的HCV标准参比血清,并比较利用该试剂和美国Abbott实验室生产的HCV第二代EIA诊断试剂平行检测109份献血员血清的结果,表明C-19肽能够特异、重复、灵敏地检出HCV血清抗体,可以作为我国第一代HCV诊断试剂的合成肽抗原。     

RT套式PCR检测血浆HCV RNA及与抗HCV检测的比较

应用微量血清热变性法提取核酸,逆转录套式聚合酶链反应(RT-nest PCR)检测血浆HCV RNA,并与抗HCV ELISA检测结果比较,对HCV RNA阳性标本进行HGV RNA的筛查.结果在32例抗HCV阳性和20例抗HCV阴性血浆中,HCV RNA分别检出18例和2例,总符合率为70%,20例HCV RNA阳性者中有2例合并感染HBV,1例合并感染HGV.证明血浆样本中抗HCV与HCV RNA间存在很大的相关性.     

我国非肠道传播非甲非乙型肝炎(丙型)病毒NS3蛋白的部份cDNA克隆及序列分析

用15ml非肠道传播非甲非乙型肝炎病人的混合血清提取病毒RNA,经逆转录和聚合酶链反应(PCR)扩增,获得583个核苷酸的非肠道传播非甲非乙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白的cDNA片段.该片段与美国报道的同片段HCV cDNA原型比较,核酸序列同源性为80.9％,氨基酸序列同源性为93.2％。与日本报道的同片段J1 HCV cDNA相比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为92.6％和95.2％。用α-~(32)P同位素标记该片段,与HCV病人血清出现杂交反应。     

反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒调控基因表达的体外抑制活性研究

为探讨反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒的抑制活性,研究和开发新型抗ＨＣＶ药物。采用ＨＣＶ５’ＮＣＲ调控荧光素酶基因的稳定表达细胞株ＨｅｐＧ２．９７０６,评价了３条针对ＨＣＶ调控基因的ＡＳＯＤＮ,即ＨＣＶ３６３,ＨＣＶ３４９及ＨＣＶ２７９。将Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ包封的ＡＳＯＤＮ与ＨｅｐＧ２．９７０６细胞株每天作用５小时,连续３天后检测荧光素酶活性。     

Identification of HCV genotypes in HCV infected blood donors

HCV infection is a leading cause of chronic liver disease, including cirrhosis of the liver. There are at least six major genotypes and more than 50 subtypes of HCV. The prevalence and distribution of HCV genotypes depend on geographical location. The aim of this study was to identify and compare the HCV genotypes in HCV infected blood donors and patients. In this cross-sectional study, 167 serum samples from 103 blood donors and 64 patients with hepatitis C were investigated for HCV genotypes. HCV genotyping was carried out using type-specific primers from the core region of the viral genome. The highest frequency was for genotype 1a, with 53 and 34 (51.5% versus 53.1%) of subjects in blood donors and patients respectively. Genotype 3a and 1b were the other frequent genotypes with 4 and 16 (3.9% versus 25%) and 39 and 10 (37.9% versus 15.6%) subjects, respectively. There was not any statistical significant association between the place of infection of the patients and genotype. The results of this study indicate that the distribution of genotypes in the two populations was similar. The dominant HCV genotypes between blood donors and patients were 1a, 3a and 1b respectively.     

Inhibition of HCV Replication in HCV Replicon by shRNAs

We show that the vector-derived long dsRNA specifically inhibits the replication of HCV RNA in HCV replicon. We designed a long dsRNA targeted to the full-length HCV IRES/core elements (1-to 377-nt). Our results revealed that the replication of HCV RNA was reduced to near background levels in a sequence-specific manner by the long dsRNAs in the HCV replicon. We also designed four shRNAs against several regions (120- to 139-nt, 260- to 279-nt, 330- to 349-nt, and 340- to 359-nt) of the HCV IRES/Core elements. The two HCV IRES/core-specific shRNAs, 330- to 349-nt and 340- to 359-nt, containing the AUG initiation codon sequence showed stronger HCV inhibitory effects than the other two shRNAs, 120- to 139-nt and 260- to 279-nt.