人肝再生增强因子在大肠杆菌中的高效表达及生物学活性研究

将人肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ亚克隆于表达质粒ｐＢＶ－２２０,构建了高效表达菌株,其特异表达蛋白占细菌可溶性蛋白的２０％,表达产物在体内具有促进肝细胞ＤＮＡ合成和提高ＣＣｌ４致中毒性肝功能衰竭大鼠存活率的作用。     

重组人肝再生增强因子在体外能刺激HTC肝癌细胞DNA合成

在成功克隆人肝再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＮＡ的基础上,本研究将人ＡＬＲ编码区ｃＤＮＡ亚克隆于真核瞬间表达质粒ｐＣＤＮＡ Ｉ,构建了真核表达质粒ｐＣＤＮＡ Ｉ－ｈＡＬＲ,转染ｃｏｓ－７细胞后,表达产物生物活性检测表明：真核表达的ｈＡＬＲ在体外能刺激ＨＴＣ肝癌细胞增殖,这一体外活性的确定为重组人ＡＬＲ的纯化提供了简洁、可靠的检测方法。     

肝再生增强因子的cDNA克隆,表达及表达产物的生物活性研究

以肝部分切除后再生肝组织为起始材料,利用ＲＴ－ＰＣＲ扩增出大夺再生增强因子（ＡＬＲ）,亚克隆子于ＰＧＥＭ－Ｔ载体,核苷酸序列测定证实为大鼠ＡＬＲ;将ＡＬＰＣＤＮＡ亚克隆于ＰＢＶ２２０质粒,构建了原核表达载体,并获高效表达菌株,特异表达蛋白占细菌总蛋白的１５％,原核表达的ＡＬＲ在体外缺乏促进大鼠原代培养肝细胞及ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞ＤＮＡ合成的活性,但天体内１／３肝部分切除模型中可刺激肝细胞ＤＮ     

人粒细胞集落刺激因子hG—CSF cDNA在大肠杆菌中表…

在不改变编码蛋白质氨基酸序列的前提下,利用合成ＤＮＡ接头的方法,在原始ｃＤＮＡ克隆基础上,构建了５＇端密码子富含ＡＴ的ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ突变体,使ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ得以在大肠杆菌中表达,但表达水平很低,借助相同的手段,在ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ ５＇端增加２４核苷酸对的ＦＬＡＧ肽编码序列,构建了ｈＧ－ＣＳＦ杂合蛋白（在ｈＧ－ＣＳＦ成熟蛋白Ｎ末端增加８氨基酸残基ＦＬＡＧ肽,二者结合点为肠激肽酶     

用荧光影像系统研究莲子叶细胞中核酸和蛋白质的含量

用酶解法解离受精后５ ｄ 和２０ ｄ 的红莲（ Ｎｅｌｕｍｂｏ ｓｐ．） 子叶细胞,应用冷却型科学级电荷偶联装置（ＣＣＤ） 摄像式显微荧光影像系统对单个５ ｄ 细胞和２０ ｄ 细胞的ＤＮＡ、ＲＮＡ和总蛋白相对含量进行了相关测量。实验结果表明：２０ ｄ 细胞ＤＮＡ成为多倍化,为４Ｃ～８Ｃ水平。视窗分析表明：同一４ＣＤＮＡ 视窗中,２０ ｄ 细胞比５ ｄ 细胞的ＲＮＡ和总蛋白含量增加１１ 倍以上。２０ ｄ 细胞的两个ＤＮＡ视窗（４Ｃ和８Ｃ） 中,随着ＤＮＡ倍性的增高,ＲＮＡ 和总蛋白含量也以大致上相应的倍数增高。这些数据表明：红莲子叶贮存蛋白的大量积累既与ＤＮＡ 倍性有关,又与发育过程中贮存蛋白亚基基因选择性的表达有关     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

人MCP cDNA在NIH3T3细胞中表达及功能研究

通过构建表达人膜辅因子蛋白ＭＣＰ编码区全长ｃＤＮＡ的重级载体ｐｃＤＮＡ３ＭＣＰ,以磷酸钙沉淀法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,用Ｇ４１８筛选阳性克隆,并鉴定ＭＣＰ ｃＤＮＡ在细胞中的表达。将血清梯度稀释并与细胞孵育,然后检测细胞活力：灭活的人血清不能引起对照细胞与ＭＣＰ转染细胞的胞毒作用,而新鲜人血清可使对照细胞发生补体依赖的细胞毒反应,ＭＣＰ转染细胞由于ＭＣＰ蛋白的合成,细胞受到保护不发生该反应。另外,Ｍ     

大鼠卵巢促黄体激素／人绒毛膜促性腺激素受体cDNA的克隆和在…

促黄体激素／人绒毛膜促性腺激素受体（ＬＨ／ｈＣＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）是一种与蛋白偶联的糖蛋白。本文报道了从大鼠卵巢ｃＤＮＡ库中筛选ＬＨ／ｈＣＧ受体ｃＤＮＡ及其在昆虫细胞中的高效表达。ＬＨ／ｈＣＧ受体ｃＤＮＡ全长２４０３ｂｐ,编码受体信号肽和成熟受体６７４个氨基酸。用多角体病毒表达载体ｐＶＬ１３９３,ＬＨ／ｈＣＧ受体ｃＤＮＡ在昆虫细胞中得到高效表达。在非还原和还原条件下的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,用     

HCV核心蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性的初步评价

通过逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从丙肝患者的血清中分离出编码完整ＨＣＶ核心蛋白（Ｃ区）的ｃＤＮＡ片段,并将其克隆到杆状病毒转移质粒中。重组转移质粒ＤＮＡ与线性的杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经蚀斑筛选获得了带编码全部核心蛋白基因的重组杆状病毒。重组病毒感染细胞后表达ＨＣＶ核心蛋白,其分子量的为２０ｋＤ。免疫印染和酶联免疫实验表明,此重组蛋白能被人ＨＣＶ阳性血清所识别。动物实验表明此重组蛋白能诱导小鼠产生特异性抗体。     

丙型肝炎病毒E2基因DNA免疫实验动物研究

将编码丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２蛋白４１７～７５０位氨基酸的ＤＮＡ片段　克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ　３．１（－）中的ＣＭＶ　ＩＥ启动子下游,构建成ＨＣＶ　Ｅ２重组真核表达质粒　ｐｃＥ２。ＥＬＩＳＡ法检测ｐｃＥ２　ＤＮＡ免疫兔血清中的Ｅ２抗体变化和维持规律,结果显示免疫２０ｄ已有　抗体产生,３０ｄ后开始进入高峰,４０ｄ时达到最高值,至第９０ｄ抗体水平保持平稳,抗体滴度　达到１∶１６００左右。流式细胞计数仪（ＦＡＣＳ）检测ｐｃＥ２　ＤＮＡ免疫鼠ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞变　化情况,与注射空载体ｐＣＤＮＡ３．１（－）的阴性鼠相比,ＣＤ４＋淋巴细胞水平略有上升,ＣＤ８＋　细胞水平有较大升高,增幅达３５．４６％。免疫组化检测结果显示注射ｐｃＥ２的小鼠组织中有明显　的阳性着色,而注射ｐｃＤＮＡ３．１（－）的对照组小鼠免疫组化结果为阴性。以上结果表明：ｐｃＥ２　在实验动物内表达出的ＨＣＶ　Ｅ２蛋白可以引起免疫动物的体液免疫应答和细胞免疫应答,尤其　是ＭＨＣ－１限制性杀伤性ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞水平的提高对清除　病毒是十分有利的,因此ＨＣＶ　Ｅ２　ＤＮＡ免疫有可能成为预防和治疗ＨＣＶ感染的一条新途径。     

丙型肝炎病毒基因组C区和NS3区基因cDNA的融合及其在大肠杆菌中的表达与初步应用

通过逆转录（ＲＴ）－聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从中国人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）携带者的血清中扩增并克隆到２段ｃＤＮＡ片段,即ＨＣＶ基因组Ｃ区抗原基因Ｃ８３１ｃＤＮＡ片断（约５３０ｂｐ）和ＮＳ３区抗原基因Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段（约８６０ｂｐ）。Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段同Ｃ８３１ｃＤＮＡ片段经连接　　　肽Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ连接成为基因嵌合体Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１（约１４００ｂｐ）。Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１基因嵌合体同温控型原核表达载体ｐＢＶ２２０重组,构建成表达质粒ｐＢＶ／Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１,并在大肠杆菌细胞中获得了重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ的表达。通过酶切分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法,对约占菌体可溶性蛋白９％的表达产物做了鉴定。采用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和盐析处理,获得粗提表达产物。粗提的表达产物经尿素裂解和离子交换层析纯化,得到可用于检测抗ＨＣＶ核壳蛋白和抗ＮＳ３区抗体的重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ。对Ｃ３３ｃ－ＣＬ做抗原性分析发现,它同时具有完整的Ｃ３３ｃ抗原和Ｃ２２抗原的免疫反应活性,完全能替代单纯的Ｃ３３ｃ和Ｃ２２抗原。该嵌合抗原在血清学诊断中有重要的应用价值,可望成为新一代ＨＣＶＥＩＡ诊断试剂的优选抗原。     

17个新的C2H2型锌指基因片段的分离与克隆

按照Ｃ２Ｈ２型锌指基因保守结构域的ＤＮＡ序列设计一对简并引物,以人基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ同源扩增,将由此获得的锌指基因片段为探针,从人胎肾、骨骼肌、骨骼组织的ｃＤＮＡ分子库中筛选到２２个Ｃ２Ｈ２型锌指蛋白ｃＤＮＡ片段,经国际ＮＣＢＩ数据库查询检索,其中１７个为新的锌指基因片段。对从胎肾ｃＤＮＡ分子库中分离到的Ｋ３－４和Ｋ５－１２克隆进行了表达谱分析,发现Ｋ３－４在肾脏中的表达量明显高于其他几     

BRCA1基因结构及其在乳腺癌中的表达

利用ＭＰＣＲ技术从乳腺组织分离到抑癌基因ＢＲＣＡ１的ｃＤＮＡ片段,将此９１４ｂｐ的片段克隆进质粒ｐＵＣ１１８,并经全序列测定证实。序列分析表明,ＢＲＣＡＩｃＤＮＡ编码的肽链ＮＮ２－末端有一锌指结构,抑癌基因ＢＲＣＡＩ的产物可能是ＤＮＡ结合蛋白,ｃＤＮＡ序列存在两个变异位点：一个是第４０９位的Ｃ→Ａ（Ａｓｐ→Ｇｌｕ）：另一个是第８７９位的Ａ→Ｔ（ＭＩａ同义突变）。以该片段为探针,检测６例乳腺癌组织中ＢＲＣＡＩｍＩＭＡ表达,一例表达明显下降,一例没检测到表达的ｍＩＭＡ产物,说明一些乳腺癌组织的ＢＲＣＡ１基因转录水平降低     

噬菌体T7溶菌酶及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

以噬菌体Ｔ７ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ扩增Ｔ７溶菌酶基因,插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ载体中,ＤＮＡ序列分析表明,克隆的Ｔ７溶菌酶基因和已报道的序列无氨基酸水平上的差异。将Ｔ７溶菌酶基因分别拼接在烟草病原相关蛋白（ＰＲ１ｂ）信号肽编码序列的３’末端和马铃薯卷叶病毒外壳蛋白（ＰＬＲＶＣＰ）基因靠近３’末端处,构建成两个融合蛋白基因。将Ｔ７溶菌酶及其融合蛋白基因插入大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２１,蛋白电泳及溶菌实验表明,Ｔ７溶菌酶基因在大肠杆菌中高效表达,其产物的表达量占菌体可溶性蛋白的２０％以上,ＰＬＲＶＣＰ的表达量并没有因Ｃ端融合Ｔ７溶菌酶而提高,高等植物的信号肽在大肠杆菌中也能起分泌信号作用。     

多聚TAR-CoreRNA诱饵对人免疫缺陷病毒1型Tat蛋白活性的抑制作用

为了抑制Ｔａｔ蛋白的反式激活作用,在细胞内大量表达外源ＴＡＲＲＮＡ使其与Ｔａｔ蛋白结合,从而竞争性抑制其与ＨＩＶ－１ＬＴＲ的ＴＡＲＲＮＡ元件结合．构建了以ＨＩＶ－１ＬＴＲＹＬ１５８（－１５８～＋１８０）为启动子,分别含有４,８和１５个拷贝的ＴＡＲ－ＣｏｒｅＲＮＡ诱饵（ｄｅｃｏｙ）表达质粒;以荧光酶基因为报告基因,检测了瞬时共转染体系中含不同拷贝数的ＴＡＲ－ＣｏｒｅＤＮＡ转录产物对Ｔａｔ蛋白反式激活作用的影响．结果证明,ＴＡＲ－ＣｏｒｅＲＮＡ诱饵对Ｔａｔ蛋白活性具有很强的抑制作用,其抑制程度与ＴＡＲ－ＣｏｒｅＤＮＡ串联体的拷贝数有关．     

抑瘤素M cDNA的克隆及表达研究

抑瘤素Ｍ是一种我功能的细胞生长调节因子,从ＰＭＡ刺激后的Ｕ９３７细胞系提取总ＲＮＡ,采用逆转录－ＰＣＲ方法分离到了抑瘤素Ｍ的ＣＤＮＡ;将抑瘤素Ｍ的ＣＤＮＡ克隆到质粒ＰＵＣ１９中,筛选三个阳性克隆进行序列分析,与国外报导序列完全一致;将抑瘤素Ｍ的ＣＤＮＡ克隆到质粒ＰＢＶ２２０后再转化ＤＨ５α进行模拟表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明有ＯＳＭ表达,表达量约占细菌总蛋白５％,经过初步纯化的ＯＳＭ能明显抑制Ａ     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

Epstein—Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白     

内皮素A型受体胞内区在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ体外重组方法,将内皮素Ａ型受体（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｔｙｐｅＡｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＥＴＡＲ）胞内区ｃＤＮＡ克隆到ｐＵＣ１８载体中进行序列分析。结果表明,ＤＮＡ序列与预期结果完全相符。然后用低熔点琼脂糖回收插入到ｐＵＣ１８载体中的ＥＴＡＲ胞内区ＤＮＡ片段,连接到ｐＧＥＸ２Ｔ融合蛋白表达载体的凝血酶位点下游,转化大肠杆菌ＪＭ１０３,得到的重组质粒命名为２Ｔ／ＥＴＡＲ。ＪＭ１０３（２Ｔ／ＥＴＡＲ）经３０℃培养、ＩＰＴＧ诱导明显表达出ＥＴＡＲ胞内区融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在。包涵体经变性和复性后,用亲和层析一步纯化法获得了较纯的ＥＴＡＲ胞内区融合蛋白,为进一步研究ＥＴＡＲ胞内区的功能打下了良好的基础     

缺氧促进热休克蛋白70在肺动脉平滑肌细胞中的表达

缺氧性肺动脉高压中肺动脉结构重组,中膜平滑肌细胞增殖并迁移,但机制不明。本研究观察缺氧对肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）细胞周期、ＤＮＡ合成及细胞增殖的影响,并通过观察缺氧对ＰＡＳＭＣ热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）表达的影响,初步探讨缺氧的作用是如何介导的。结果表明缺氧可直接或协同内皮质－１促进ＰＡＳＭＣ ＤＮＡ合成及细胞增殖,并可增加ＨＳＰ７０在ＰＡＳＭＣ中的表达。