LRP16与 ERα相互作用增强ERα介导的转录活性

LRP16是一个雌激素（E2）通过受体α（ERα）诱导表达的靶基因,LRP16不仅促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,而且促进细胞的侵袭生长,但对LRP16作用的分子机制尚不清楚.首先,检测到LRP16表达缺陷明显削弱了MCF-7细胞对E2的反应性增殖能力;采用Northern 印迹与Western印迹法,进一步检测到抑制LRP16表达,明显损害了ERα靶基因对E2诱导上调的反应性,这些基因包括了cyclin D1, c-myc, c-fos,MTA3, pS2和维甲酸受体α基因（RARα）等;以上结果提示,LRP16参与了ERα介导的信号途径.将ERα模式启动子报告基因3×ERE-TATA-luc,ERα以及LRP16表达载体共转染MCF-7与HeLa细胞.结果发现,LRP16增强了ERα对报告基因的转录激活,并呈现对LRP16的剂量依赖性;进而采用GST-pull down以及免疫共沉淀方法证实了LRP16与ERα之间的直接相互作用,该作用不依赖于E2的存在,但可被E2增强;采用哺乳动物双杂交方法进一步证实了ERα与LRP16相互作用位点存在于A/B区的激活功能域-１（AF1）.以上结果表明,LRP16是ERα的一个共激活因子,通过相互作用,LRP16增强了ERα介导转录活性.该研究为LRP16促进ERα阳性乳腺癌细胞增殖与侵袭生长提供了合理的分子解释.     

ERα辅调节因子在乳腺癌中的双重调控作用

在发达国家,乳腺癌一直是威胁女性健康的恶性肿瘤之一。雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)是一种配体依赖性的转录因子,其介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭和转移等过程中发挥重要作用。ERα主要依赖于辅调节因子共同调控下游靶基因的表达。近年来,有研究证实,一些关键转录辅调节因子在调节ER转录活性的同时,也可以作为泛素E3连接酶,促进ERα的降解。该文详细介绍几种辅调节因子对ERα的双重调节作用,有助于从分子水平阐明不同类型乳腺癌中造成ERα表达量差异的机制,为乳腺癌的靶向治疗和预防提供理论依据。     

ERα的辅调节因子与乳腺癌关系的研究进展

雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）是配体依赖的转录因子,属于核受体超家族成员。ERα介导转录的经典途径是与雌激素结合后作用于靶基因启动子区的雌激素反应元件（estrogen response element,ERE）,进而诱导靶基因转录。ERα招募辅调节因子（共激活子和共抑制子）参与ERα介导的基因转录调控。辅调节因子主要通过乙酰化、磷酸化、甲基化等表观遗传机制参与转录调控,影响靶蛋白表达水平。ΕRα介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭转移等过程中发挥重要作用。综述在ERα介导的基因转录调控中几类辅调节因子对乳腺癌发生发展的影响。     

ER/PR阳性和阴性乳腺癌的定量蛋白质组学和生物信息学比较研究

目的:建立雌/孕激素受体(ER/PR)阴性和阳性乳腺癌的蛋白质表达谱,寻找ER/PR阴性和阳性乳腺癌中差异表达蛋白,为乳腺癌患者提供新的预后预测指标和治疗新靶点。方法:应用蛋白质组学i TRAQ技术建立ER/PR阳性和阴性乳腺癌的蛋白质差异表达谱,鉴定两组乳腺癌的差异表达蛋白,对部分差异表达蛋白进行生物信息学分析,包括蛋白功能注释和分类GO分析和KEGG通路分析。结果:应用i TRAQ蛋白质组学技术对乳腺癌组织进行了蛋白组学分析,鉴定出ER/PR阳性和阴性组间有差异表达的蛋白4999种,以ER/PR阳性:ER/PR阴性≥3为上调标准,确定ER/PR阳性组上调蛋白101种。以ER/PR阳性:ER/PR阴性≤0.5为下调标准,ER/PR阳性组下调蛋白122种。GO分析结果显示ER/PR受体阴性和阳性乳腺癌的差异表达蛋白的分子功能、生物过程、细胞定位较为复杂,并且在上调蛋白和下调蛋白上存在分布差异。KEGG通路分析发现部分差异表达蛋白涉及201条信号通路。结论:ER/PR阳性和阴性乳腺癌间存在差异表达蛋白,这些蛋白涉及复杂的分子功能、生物过程和信号通路。     

EN1调节UTROPHIN表达机制

为了探讨人类UTROPHIN蛋白表达上调的可能因素,文章利用P-match软件预测人类UTROPHIN基因启动子区域可能的调控元件,应用CHIP和EMSA实验加以验证,并利用RNA干扰和荧光定量PCR的方法分析人类EN1转录因子调节UTROPHIN表达的作用机制。经P-match软件预测,UTROPHIN基因启动子区域有2个转录因子EN1的可能结合位点,经CHIP和EMSA实验证实位点2是真正结合位点。通过RNA干扰实验,发现在HeLa细胞中EN1基因沉默后,可使UTROPHIN mRNA水平上调。以UTROPHIN蛋白为靶点可能为DMD(Duchenne muscular dystrophy)基因治疗提供一种新的策略。     

ERα-36和STAT3协同促进乳腺癌细胞的迁移

[目的]探讨ERα-36和STAT3通过MMP2和MMP9对乳腺癌细胞迁移的影响。[方法]使用Transwell实验检测ERα-36和STAT3对乳腺癌细胞迁移能力的影响,荧光定量PCR和Western Blot检测在乳腺癌细胞中过表达ERα-36和STAT3对MMP2和MMP9表达的影响,Luciferase实验检测ERα-36和STAT3对MMP2和MMP9启动子转录活性的影响。[结果]与对照组相比,过表达STAT3组的乳腺癌细胞迁移能力明显升高(P 0. 05),两种与迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达量均升高(P 0. 05);过表达STAT3增强了乳腺癌细胞中MMP2和MMP9的转录活性,而ERα-36过表达对MMP2和MMP9的转录活性具有较弱的影响。但是共表达ERα-36和STAT3显著增强了MMP2和MMP9的转录活性与表达。[结论]ERα-36和STAT3协同结合到MMP2和MMP9的启动子上,促进它们的转录与表达进而促进乳腺癌细胞迁移。     

新型雌激素受体ERα30过表达促进人乳腺癌细胞的增殖及其机制

为进一步探讨前期报道的新型人雌激素受体ERα30的功能及其作用机制,本研究应用EdU法研究新型人雌激素受体ERα30过表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖能力的影响,并通过实时荧光定量RT-PCR检测ERα相关靶基因的差异表达。结果显示,ERα30过表达促进了MDA-MB-231细胞的增殖,同时上调了c-jun及EGFR基因的表达,提示ERα30可能通过非经典机制发挥作用。本研究为后续深入研究ERα30在乳腺癌发生发展中的作用提供了良好的基础,为乳腺癌的诊断、治疗及预后提供新的视角。     

HOXA10直接调控人子宫内膜间质细胞中p/CAF启动子的活性

目的：筛选与鉴定转录因子同源框蛋白（HOX）A10下游靶基因。方法：用Ad-HOXA10重组腺病毒感染人子宫内膜间质细胞,通过染色体免疫共沉淀（ChIP）方法,筛选HOXA10的下游靶基因;采用萤光素酶报告基因实验结合腺病毒介导的HOXA10过表达和小干扰RNA介导的基因沉默实验,分析HOXA10对下游靶基因的转录调控作用。结果：ChIP-PCR筛选并鉴定p/CAF（p300/CBP相关因子）为HOXA10直接作用的靶基因;过表达HOXA10抑制p/CAF启动子活性达60%;基因沉默内源性HOXA10的表达可以激活p/CAF启动子活性超过2倍以上。结论：p/CAF是HOXA10新的靶基因,HOXA10可能通过调节p/CAF的表达来调控子宫内膜的发育。     

果蝇组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3选择性调控形态发生素靶基因转录

在真核细胞中,组蛋白的乙酰化状态对于基因转录的正常进行具有重要的调控作用。组蛋白的乙酰化修饰由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases,HATs)执行,这种修饰是动态的、可逆的,负责去乙酰化修饰的酶是组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs),推测HDACs可能通过影响组蛋白的乙酰化状态在基因的转录过程中发挥调控作用。该文以组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3为对象,研究了它们在果蝇翅膀发育过程中对Wg(Wingless)、Hh(Hedgehog)以及Dpp(Decapentaplegic)信号通路下游靶基因转录的调控作用。结果发现,HDAC1功能缺失可导致Dpp下游靶基因Omb(optomotor-blind)和Hh下游靶基因Ptc(patched)的表达上调。Real-time quantitative PCR(RT-q PCR)结果显示,在HDAC1基因敲除的果蝇中,Ptc、Ci(cubitus interruptus)以及Omb的转录水平增加。HDAC3缺失导致Sal(spalt)的表达上调。RT-q PCR结果证实了HDAC3基因敲除果蝇的Sal转录增加,同时发现Vg(vestigial)的转录下降。而过表达HDAC1或HDAC3对下游靶基因的表达则没有影响。综上所述,该研究表明,HDAC1和HDAC3可以选择性地调控形态发生素下游靶基因的转录。     

LRP16通过调控E-钙粘合素的表达促进MCF-7细胞的侵袭生长

LRP16在原代乳腺癌组织中表达水平与雌激素受体α（ERα）表达状态以及腋窝淋巴结侵袭数目密切相关.为研究LRP16基因对乳腺癌MCF-7细胞侵袭生长的影响,并探讨涉及的分子机制,采用基质胶黏附实验与Transwell方法,检测内源性LRP16表达抑制MCF-7细胞的体外黏附、侵袭生长与迁移特征.结果表明,抑制LRP16在MCF-7细胞中的表达,降低了细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力;采用FVB小鼠进行的实验性转移试验结果显示,抑制LRP16显著降低了MCF-7细胞的肺转移结节数目;为探索可能的分子机制,采用Western印迹方法,检测了LRP16对乳腺癌转移相关分子MMP-2, MMP-9, CD44和E-钙黏着蛋白表达的影响,结果在LRP16抑制的MCF-7细胞中只有E-钙黏着蛋白蛋白表达上调.进一步的Northern印迹与免疫组化实验结果表明,抑制LRP16可上调MCF-7细胞中E 钙黏着蛋白基因的mRNA与蛋白表达水平;共转染与双荧光素酶方法检测LRP16对E-钙黏着蛋白基因启动子的表达调控效应,结果显示,LRP16抑制E 钙黏着蛋白基因基因5′-近端启动子的转录激活,该抑制效应选择性存在于内源性ERα阳性细胞,并且依赖于雌激素的存在;染色质免疫共沉淀方法（ChIP）检测ERα与E-钙黏着蛋白基因启动子的相互作用,结果显示,在LRP16基因表达缺陷的MCF-7细胞中,ERα抗体沉淀到E-钙黏着蛋白基因启动子的DNA序列;上述研究结果表明,抑制LRP16基因表达,削弱了激素依赖型乳腺癌细胞的侵袭生长能力,其分子机制涉及了LRP16通过ERα介导对E-钙黏着蛋白基因基因转录激活的调控.     

ERα与Sp1相互作用激活LRP16启动子转录活性

根据已报道的LRP1 6启动子序列 (2 6kb) ,采用PCR反应获得 6个启动子 5′删除突变体 ,分别插入pGL3 Basic载体 ,构建 6种 5′缺失报告基因表达载体 (pS1 ～pS6) .分别与ERα真核表达载体共转染MCF 7细胞 .用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性 ,以明确LRP1 6基因上游启动子区域中的雌激素反应序列 .结果显示 ,pS1 ～pS6均有雌二醇反应性 .进而对pS5的 3′端缺失分析发现LRP1 6基因翻译起始位点上游 - 2 1 4至 - 2 5 1位置的序列具有雌激素应答 ,序列分析发现该片段序列中包含了一个供转录因子Sp1结合的GC富含位点和一个ERα反应元件的半位点 (1 2ERE Sp1 ) ,进一步突变分析显示这两个元件均为雌激素反应性所必需 .以含这两个顺式元件的序列 (- 2 5 3bp至 - 2 2 4bp)作为探针 ,超级迁移凝胶电泳试验结果表明了ERα和Sp1蛋白均可以和探针结合 .研究发现了雌激素上调LRP1 6基因表达的一个增强子元件— 1 2ERE Sp1 ,ERα和Sp1蛋白需要与DNA结合形成复合体 ,通过其相互作用激活转录     

副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS间接抑制VP1687-1686的启动子区转录

为了探讨副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS对Ⅲ型分泌系统(T3SS) VP1687-1686基因位点的转录调控,本研究提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA,采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对靶基因的调控关系;采用实时定量RT-PCR研究靶基因mRNA在WT和Δhns中转录丰度,以判定H-NS对靶基因的转录调控关系;将靶基因启动子区域DNA序列克隆至lacZ基因上游,将重组质粒转入WT和Δhns中,得到相应的LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对靶基因的调控关系;用PCR扩增靶基因的启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS是否对靶基因启动子区具有直接的结合作用。研究结果显示,T3SS的VP1687-1686只含有一个转录起始位点,位于翻译起始位点上游82 bp处,且H-NS能够抑制其转录活性,但不能直接结合到VP1687-1686区的启动子区。另外,H-NS对calR的转录无调控作用,His-H-NS也不能结合到其启动子区。本研究的结果初步说明,H-NS能够间接抑制VP1687-1686的转录,该抑制机制与CalR无关联。     

副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS间接抑制VP1687-1686的启动子区转录

为了探讨副溶血性弧菌拟核相关蛋白H-NS对Ⅲ型分泌系统(T3SS) VP1687-1686基因位点的转录调控,本研究提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA,采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对靶基因的调控关系;采用实时定量RT-PCR研究靶基因mRNA在WT和Δhns中转录丰度,以判定H-NS对靶基因的转录调控关系;将靶基因启动子区域DNA序列克隆至lacZ基因上游,将重组质粒转入WT和Δhns中,得到相应的LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对靶基因的调控关系;用PCR扩增靶基因的启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS是否对靶基因启动子区具有直接的结合作用。研究结果显示,T3SS的VP1687-1686只含有一个转录起始位点,位于翻译起始位点上游82 bp处,且H-NS能够抑制其转录活性,但不能直接结合到VP1687-1686区的启动子区。另外,H-NS对calR的转录无调控作用,His-H-NS也不能结合到其启动子区。本研究的结果初步说明,H-NS能够间接抑制VP1687-1686的转录,该抑制机制与CalR无关联。     

ChREBP在肝细胞糖脂代谢中的作用

碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response element binding protein,ChREBP)是一个在糖脂代谢过程中发挥重要作用的转录因子.ChREBP的分子量约为90kD,含有四个与其活性紧密相关的磷酸化位点.葡萄糖代谢旁路产物5-磷酸木酮糖可以激活蛋白磷酸酶2A,其促使ChREBP去磷酸化,去磷酸化的ChREBP进入细胞核,并与MLX形成异源二聚体ChREBP/MLX,ChREBP/MLX结合到靶基因启动子区域的ChRE上,激活靶基因的转录.ChREBP的靶基因主要是参与糖酵解和脂质合成的一些酶类,因而ChREBP的激活可促进葡萄糖向脂质转化.敲除ChREBP的小鼠虽可正常生长发育但其体内脂肪组织明显减少,同时肝中有大量糖原堆积而导致肝肿大.敲除ChREBP的ob/ob小鼠,体重及糖脂代谢紊乱也有明显改善.总之,现有的研究揭示ChREBP有可能成为治疗代谢综合征的一个新靶点.     

过表达E2F6基因抑制BRD7基因启动子活性

BRD7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新Bromodomain基因(GenBank 登录号AF152604)。它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达BRD7基因可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期的进程。前期工作已克隆了BRD7基因启动子区,并将其启动子定位于450bp（-404→+46bp）的区域。为了进一步揭示BRD7基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,生物信息学分析表明BRD7启动子区有E2F6转录因子结合位点,电泳迁移率实验结果表明转录因子E2F6特异性地结合于BRD7启动子区。荧光素酶检测和绿色荧光蛋白表达检测都证实过表达E2F6基因能抑制BRD7基因启动子活性     

小鼠T-bet逆转录病毒载体的构建与功能验证

为在小鼠细胞中表达并研究T-bet功能,首先构建了含有报告基因Thy1.1的小鼠T-bet逆转录病毒载体,并将构建的载体质粒转染病毒包装细胞系包装成重组病毒,再利用重组病毒分别感染NIH-3T3和D9细胞系检测其感染能力。之后,使用该重组病毒感染T-bet敲除小鼠的CD4+T淋巴细胞,流式细胞术检测T-bet及其下游靶基因Ifng的表达情况。经验证,重组的逆转录病毒感染T-bet敲除小鼠T淋巴细胞后可以在细胞中表达T-bet,并进一步引起下游靶基因Ifng的表达上调,证明本研究中外源表达的转录因子T-bet具有正常功能。综上所述,本实验成功构建了含有报告基因的小鼠T-bet重组逆转录病毒载体,为进一步在小鼠细胞中研究T-bet功能奠定了基础。     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

利用CRISPR/Cas9系统检测果蝇细胞中组蛋白甲基化修饰对20E信号传导的调控

【目的】利用CRISPR/Cas9基因敲除系统在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中筛选并检测组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20 羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)信号传导的调控。【方法】通过Flybase网站分析并总结黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点;将5个组蛋白甲基转移酶基因［trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg］的sgRNA插入到敲除载体pAc-sgRNA-Cas9骨架中并转染黑腹果蝇Kc细胞,利用TA克隆和测序鉴定突变位点。以Trr正调控20E初级应答基因Br-C的转录表达为阳性对照,利用qRT-PCR和Western blot检测该系统敲除靶基因的有效性;通过检测20E应答元件(20E response element, EcRE)双荧光素酶活性确定trr, Mes-4, ash1, Su(var)3-9和egg是否参与20E信号传导。【结果】果蝇组蛋白甲基化修饰主要发生在组蛋白H3的赖氨酸残基上,H3的精氨酸残基和组蛋白H4的甲基化修饰较少。trr敲除载体pAc-trr-sgRNA-Cas9转染Kc细胞后成功突变trr,降低H3K4三甲基化水平并阻断20E对其初级应答基因Br-C的转录诱导,证明该敲除系统的有效性。除trr之外,Mes-4和egg的敲除降低EcRE的双荧光素酶活性。【结论】插入靶标基因sgRNA序列的pAc-sgRNA-Cas9敲除载体在果蝇Kc细胞中可以有效快捷地突变靶基因。利用该敲除系统发现,除Trr之外,Mes-4和egg影响EcRE的活性而参与20E信号传导。本研究为昆虫细胞CRISPR/Cas9介导的基因敲除和组蛋白甲基化修饰调控20E信号传导的深入研究提供了理论依据与工作基础。     

与结瘤基因nodF的启动子相互重叠的启动子起始一个RNA分子的转录(英文)

在根瘤菌中 ,结瘤基因的表达受到转录水平上复杂的调控。通过体外转录、引物延伸等一系列实验在豌豆根瘤菌中发现一个与结瘤基因nodF的启动子相互重叠 ,但转录方向相反的启动子 ,该启动子特异起始一个新的RNA分子———px2 的转录。Northern印迹确定 px2 的长度为 0 .72kb ,并且证明 px2 的转录是依赖于根瘤菌的与E .coliσ70 同源的sigma因子。px2的转录启始位点在体内、体外均相同 ,它坐落在结瘤基因顺式元件的“nodbox”内。进一步发现 px2 的体外转录受到一个参与结瘤基因调控的蛋白———Px的抑制。有结果显示 ,px2 影响结瘤基因的表达     

PC-1增强受体酪氨酸激酶家族成员EphA3在前列腺癌细胞中的转录

为了研究前列腺癌相关基因(prostate and colon gene 1, PC-1）对受体酪氨酸激酶家族分子EphA3表达的影响,用RT-PCR、实时PCR和Western印迹检测表达不同水平PC-1的前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2中EphA3的表达情况. 发现PC-1可诱导EphA3基因表达上调. 采用荧光素酶实验检测PC-1对于EphA3启动子转录活性的影响,结果显示,PC-1对转录起始位点上游916 bp的启动子活性没有影响,而可增强转录起始位点上游2011 bp启动子的活性.对EphA3启动子－916 bp～－2　011 bp区域进行生物信息学分析,结果显示,此区域包含HSF、NF-1、Nkx-2、SP1和GATA-1等多种转录因子结合位点.实验结果表明,PC-1可通过影响EphA3启动子诱导EphA3基因高表达,其调控区域位于转录起始位点上游－2　011　bp至－916 bp之间,提示PC-1可能通过影响一些结合于此区域的转录因子来影响EphA3启动子的转录活性.