过表达E2F6基因抑制BRD7基因启动子活性

BRD7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新Bromodomain基因(GenBank 登录号AF152604)。它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达BRD7基因可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期的进程。前期工作已克隆了BRD7基因启动子区,并将其启动子定位于450bp（-404→+46bp）的区域。为了进一步揭示BRD7基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,生物信息学分析表明BRD7启动子区有E2F6转录因子结合位点,电泳迁移率实验结果表明转录因子E2F6特异性地结合于BRD7启动子区。荧光素酶检测和绿色荧光蛋白表达检测都证实过表达E2F6基因能抑制BRD7基因启动子活性     

裂解性复制诱导产生可视化重组Epstein Barr病毒

为了在病毒的整个基因组中研究基因的功能,分析基因与基因之间的相互作用,含有整个野生型EB病毒(EBV)基因组的BAC-EBV质粒(p2089),首先被转染EBV阴性的HEK293细胞,经潮霉素筛选建立了HEK293/p2089稳定细胞系.再构建pcDNA3.1( )/BZLF1和pcDNA3.1( )/BALF4真核表达质粒,共转染至HEK293/p2089细胞内,诱导EBV裂解性复制产生可视化的重组EBV颗粒.重组EBV颗粒感染Raji细胞,在倒置荧光显微镜下和流式细胞仪记数GFP阳性细胞,根据这些"绿色Raji单位"确定病毒的滴度.在国内首次建立这种以细菌人工染色体(BAC)为基础的EBV感染性克隆技术,将允许对EB病毒基因组中任何基因的任何遗传修饰,为在整个基因组中对EB病毒基因功能的研究奠定了基础,也为对EBV与其相关的肿瘤如鼻咽癌发生机理的研究建立了新的技术平台.     

NGX6基因抑制高转移鼻咽癌细胞的侵袭运动能力

 NGX6 基因是我室利用定位候选克隆策略,在鼻咽癌的高频杂合性缺失区9p21-22克隆的新基因.前期研究结果提示,它与鼻咽癌细胞的侵袭转移密切相关.为了进一步阐明其作用的结构基础,本研究成功构建了含NGX6基因及突变体的pCMV-myc瞬时和pcDNA3.1-his-myc(-)B稳定表达载体.通过脂质体转染技术,构建了NGX6及突变体的稳定表达细胞系5-8F.用免疫荧光试验和免疫电镜观察了NGX6在5-8F细胞中的亚细胞定位主要位于胞膜、核膜以及胞浆中的膜质结构,缺失突变的功能域对其定位没有明显的影响.基质胶侵袭试验和划痕试验研究了NGX6及突变体对细胞运动的影响.NGX6能抑制高转移潜能的鼻咽癌细胞5-8F的运动和侵袭能力,缺失胞内区（CYTO）后NGX6不能抑制5-8F细胞的运动和侵袭,提示CYTO可能是其发挥作用的重要功能域.     

鼻咽癌的表观遗传学研究进展

表观遗传学是功能基因组学的重要组成部分,它实际上是研究理化、生物等环境因素以及饮食习惯等对遗传因素的作用,并由这一作用引起DNA序列以外的遗传物质改变.鼻咽癌是我国南方常见恶性肿瘤,具有明显的家族聚集倾向,存在基因组不稳定性,易受理化、生物等环境因素的影响,是多基因遗传性肿瘤.鼻咽癌这种独特病因体系提示:鼻咽癌是研究肿瘤表观遗传修饰的最佳模型之一.主要从DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构和非编码RNA的调控4方面对鼻咽癌表观遗传学研究进展进行综述并针对性地提出了一些新的建议,目的是为进一步探究鼻咽癌表观遗传学发病机制,更好地全面理解鼻咽癌的病因发病机制网络体系,寻找鼻咽癌高危易感人群的筛查、早期诊断、治疗、预后判断的表观遗传修饰分子标志物开辟新的前景.     

SPLUNC1多肽抗体的设计、制备与鉴定

通过设计SPLUNC1蛋白的一段多肽,快速制备抗SPLUNC1的多肽抗体,检测多肽抗体的性能,为SPLUNC1的功能研究提供可靠的平台. 用DS Gene1.1软件分析SPLUNC1蛋白的跨膜结构域、二级结构、疏水性、亲水性以及抗原性等,综合考虑抗体设计的其它因素,设计出两段15～20个氨基酸的多肽.将合成后的多肽与钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶联,同时初筛出宿主血清与SPLUNC1无交叉反应的新西兰家兔,用与KLH相连的SPLUNC1多肽免疫家兔,2个月后获取血清,亲和纯化出抗SPLUNC1多肽抗体,通过ELISA法检测其效价,免疫印迹与免疫组化检测其特异性与适用范围.通过该方法得到了高效价与高特异性的SPLUNC1多克隆特异性抗体,ELISA法测定其效价可达到1∶10⁵,通过对包含有PLUNC家族不同成员的蛋白混合物进行Western印迹检测证明,该多肽抗体具有较高的特异性,不与同一家族中的其它蛋白发生交叉反应,而且该抗体可用于免疫组化,说明所制备的分泌性蛋白SPLUNC1抗体具有高特异、高效价等特点,将为SPLUNC1基因的功能研究提供有用的研究材料.     

NGX6基因在多种常见癌组织中的原位表达及其临床意义的研究

研究新的候选抑瘤基因NGX6在多种常见癌组织中的mRNA原位表达谱,分析NGX6 mRNA阳性率与肿瘤1临床病理特征的关系并评估其作为肿瘤转移、预后预测分子标志物的有效性.利用已制作的多肿瘤组织和鼻咽癌组织微阵列,原位杂交检测NGX6 mRNA在多种常见癌组织中的阳性率.结果显示.NGX6 mRNA在鼻咽癌、肺癌、胃癌和结、直肠癌中的阳性率低于其对应的正常组织(P＜0.05,P＜0.01).淋巴结转移性鼻咽癌、肺癌、结、直肠癌和喉癌组织中的NGX6 mR.NA阳性率显著降低(P＜0.05,P＜0.01).NGX6 mRNA阳性率与鼻咽癌、肺癌和结、直肠癌临床分期有关,临床Ⅱ期、Ⅲ期或Ⅳ期癌组织NGX6 mRNA阳性率明显低于其相应的临床Ⅰ期癌(P＜0.05,P＜0.01).研究表明,鼻咽癌、肺癌、胃癌和结、直肠癌中存在低水平的NGX6 mRNA,NGX6 mRNA可作为鼻咽癌、肺癌和结、直肠癌侵袭、转移和临床进展预测的分子标志.     

一个肝癌相关长链非编码RNA的克隆及序列分析

最近我们利用新一代测序(next generation sequencing,NGS)技术对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者活检标本及正常对照肝组织样品进行高通量RNA测序(RNA-sequencing,RNA-Seq),在肝癌样品中染色体11q13.1区域检测到几个相邻的RNA-Seq信号峰,而在正常对照组织中没有检测到,且该染色体区域目前尚无已知基因登录,提示这几个RNA-Seq峰可能代表一个或多个未知的新基因.以此为线索,证实这几个RNA-Seq峰来自同一个新基因,并克隆了该基因全长序列,在克隆该基因全长序列时,发现该基因编码的RNA存在多种剪接形式,最长的转录本为3 562 bp.将该基因编码的12条代表性RNA转录本序列递交到美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的GenBank数据库中,GenBank ID号分别为KC136297~KC136308.该基因编码的RNA没有发现明显的开放阅读框(open reading fragment,ORF),提示该基因可能编码长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA).为了探讨该lncRNA基因可能的转录调控机制,我们用生物信息学方法预测了该lncRNA基因潜在启动子区域,发现在其转录起始位点上游-719~-469 bp处有一个潜在的启动子,其中包含7个Sp1、1个STAT5和1个EGR1转录因子结合位点.该lncRNA在肝细胞癌发生发展过程中的作用机制值得进一步深入研究.     

两种源于胶原Ⅳ非胶原区具有抑制血管形成和肿瘤生长的功能肽

Tumstatin和Canstatin是继Restin,angiostatin和endostatin之后最新发现的基底膜来源人胶原Ⅳ肿瘤血管生成抑制因子。Tumstatin 来源于胶原Ⅳα3链,其N－端54－132氨基酸功能肽能够抑制内皮细胞增殖和诱导内皮细胞凋亡,N－端197－215氨基酸[α3（Ⅳ）NC1 185－203氨基酸]功能肽能够抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖。Canstatin是来源于Ⅳ型胶原α2链的24kD的血管生成和肿瘤生长抑制因子,它能剂量依赖性抑制内皮细胞管状结构的形成,有效抑制内皮细胞的增殖和迁移,并能诱导内皮细胞凋亡。在小鼠移植瘤模型体内实验中,Tumstatin和Canstatin都显示出对实体瘤生长的显抑制作用。     

BRD7的亚细胞定位及其假定核输出信号序列的分离与鉴

BRD7被鉴定为一个鼻咽癌密切相关新基因和潜在的核转录调节因子．通过绿色荧光蛋白(GFP)介导的亚细胞定位方法,系统研究BRD7在非洲绿猴肾COS7细胞、人宫颈癌HeLa细胞以及人鼻咽癌HNE1细胞中的亚细胞定位,发现BRD7主要定位在细胞核,呈细点状或条梭状分布,3株细胞中没有明显的细胞类型差异．通过对BRD7编码蛋白氨基酸序列进行比对分析,发现了1个具有亮氨酸富集特征的假定核输出信号序列pNES,该区域具有类似核输出信号特征序列“ L-x(2,3)-［LIVFM］-x(2,3)-L-x-［LI］ "（X代表任意氨基酸）的结构;通过功能分析,发现它不具有介导异源蛋白GFP胞浆定位的功能,且其亚细胞定位或胞浆/胞核分布比例不受细霉素B(leptomycin B)干预的影响,说明这个pNES不具核输出信号结构域的功能,不是BRD7的核输出信号．     

鼻咽癌细胞5-8F通过TLR4介导的信号通路对革兰氏阴性细菌脂多糖的反应性研究

鼻咽上皮细胞无时无刻不暴露和接触到共生微生物与病原微生物,机体依靠天然防御系统和抗原识别的适应性免疫反应系统来进行自我保护.慢性感染的重要毒力因素被认为是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分脂多糖(LPS),对LPS的识别与信号传导是宿主细胞抵御革兰氏阴性细菌的关键.通过流式细胞术、RT-PCR等研究发现,5-8F细胞可与LPS相结合并产生反应,且其受LPS调节的机制是由于5-8F细胞中存在LPS受体分子如CD14、TLR4与MD2等的表达.同时应用免疫荧光、蛋白质印迹、荧光素酶报告系统等研究发现,5-8F细胞可受到LPS的诱导而活化TLR4的下游信号传导通路.5-8F细胞在LPS的诱导下,磷酸化NFκBp65的表达增加,并且使NFκBp65活化迁移至核内.研究还发现,LPS增加TNF-α全长启动子活性,同时LPS可使5-8F细胞中TNF-α的分泌增加,从而介导炎性因子的释放.因此,5-8F细胞可通过与LPS受体分子:CD14、TLR4及MD2与LPS相结合并反应,从而激活TLR4介导的NFκB信号通路,使炎性因子的释放增加,导致鼻咽部的炎症反应诱发鼻咽癌.