9V型肺炎球菌疫苗中多糖含量微孔板蒽酮-硫酸检测方法的建立及验证

目的建立微孔板蒽酮-硫酸法检测9V型肺炎球菌疫苗中多糖含量的检测方法,并对其进行验证和初步应用。方法通过对蒽酮-硫酸方法的改进,建立检测9V型肺炎球菌疫苗中多糖含量稳定可靠的微孔板蒽酮-硫酸法。分别对蒽酮-硫酸法中硫酸溶液浓度、加热时间进行优化,并对建立的方法进行特异性、线性、精密度及准确度的验证。结果最佳硫酸溶液比例为6∶1(浓硫酸∶水),最佳加热时间为10 min。在检测9V型肺炎球菌多糖、多糖衍生物及多糖蛋白结合物中多糖含量时,此方法特异性强;在20~120μg/m L范围内,标准曲线线性良好(r20.995);实验内及实验间均具有良好的精密度(CV值分别为2.92%~3.32%和3.10%~4.06%);准确度试验中3个质量浓度的回收率均在96.17%~106.63%之间。结论微孔板蒽酮-硫酸法可被用来有效、准确、稳定地检测9V型肺炎球菌多糖、多糖衍生物及多糖蛋白结合物中多糖的含量,该方法较传统蒽酮-硫酸法操作简便快捷,节约样品、试剂等材料,非常适用于相关的疫苗生产过程中的质量控制。     

肺炎球菌免疫血清库的建立及应用

目的建立24个血清型的肺炎链球菌(简称肺炎球菌)免疫血清库,为肺炎球菌疫苗中各型多糖含量准确测定提供可靠保障。方法 (1)制备肺炎球菌各型免疫血清:用肺炎球菌菌株制备免疫原,按免疫程序接种青紫蓝兔,将符合规定的免疫血清合并、除菌、分装后建档;(2)鉴定肺炎球菌各型免疫血清:全程采用速率散射比浊法进行鉴定。首先确定肺炎球菌免疫血清工作浓度,再通过特异性和线性对免疫血清进行初步筛查(将筛查出有交叉反应的免疫血清进行吸收),然后用血清交叉试验进行再次筛查,最后通过绘制反应曲线(截取多糖质量浓度1.0~5.0μg/m L的线段)对免疫血清进行线性评定;(3)肺炎球菌免疫血清库的应用:用建成的肺炎球菌免疫血清库中各型免疫血清和丹麦国家血清研究所的诊断血清,检测5个厂家的23价肺炎球菌多糖疫苗的各型多糖含量,对比结果。结果建成的肺炎球菌免疫血清库各型免疫血清效价较高;初步筛查出的有交叉反应的免疫血清,经吸收后交叉反应消失且线性良好(R20.98);通过血清交叉试验再次筛查,未见有交叉反应的免疫血清;反应曲线线段(多糖质量浓度1.0~5.0μg/m L)线性良好(R20.98);应用两套血清检测23价肺炎球菌多糖疫苗的多糖含量,差异无统计学意义(P0.05)。结论成功建立了肺炎球菌免疫血清库,且各型免疫血清稳定、无交叉反应,可用于肺炎球菌疫苗及其疫苗血清型多糖的各项免疫学检测。     

肺炎球菌1型荚膜多糖多克隆抗体制备与夹心ELISA法建立及其在多糖浓度测定中的应用

目的：利用肺炎球菌1型全菌体制备多克隆抗体,并且利用该抗体建立肺炎1型荚膜多糖夹心酶联免疫吸附分析法（ Enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA）,用于检测发酵和纯化过程中的多糖浓度。方法用灭活的1型肺炎链球菌免疫家兔6周,获得高滴度的抗多糖血清,经过亲和层析纯化,获得高纯度的兔抗肺炎1型多糖抗体IgG。以纯化IgG作为包被抗体,加入多糖样品,再以生物素化的抗体作为检测抗体,建立夹心ELISA法检测肺炎1型多糖浓度。确定标准曲线的最佳线性范围,并对该方法进行特异性、准确性和精密度验证。结果兔免疫血清经过双向免疫扩散检测抗体滴度可达1∶32;该方法的线性检测范围为1．56～50 ng/mL;最低检测限为3．13 ng/mL。在标准品中混入其他型别多糖或培养基,回收率分别为102％和108％;该方法批内精密度和批间精密度分别为6．08％和7．01％。结论建立的夹心ELISA方法,其特异性、准确性和精密度均良好,可以特异地检测肺炎球菌1型多糖浓度。     

核磁共振波谱法在肺炎球菌荚膜多糖检定中的应用

目的 建立1 H-NMR波谱法检定23价肺炎球菌荚膜多糖结构的方法.方法 用1H-NMR方法分析肺炎球菌荚膜多糖,选择(5.89～4.64) ppm区作为‘指纹’鉴定区,以默克公司公布的肺炎球菌荚膜多糖波谱为参照谱图,将检定样品的波谱与其相比较.对1 H-NMR波谱进行专属性和耐用性验证.结果 实验中应用1H-NMR波谱分析法对23价肺炎球菌多糖疫苗包含的所有血清型多糖的检定结果与默克公司公布的结果完全一致,该方法有很好的专属性和耐用性.结论 实验中建立的1H-NMR波谱法适用于肺炎球菌荚膜多糖的检定,与传统方法相比,该方法有检测速度快,样品易于准备的优点等.     

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法检测A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖含量

目的用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖含量,并对该方法进行验证及初步应用。方法采用Carbo Pac~?PA-1 4×250 mm分析柱与Aminotrap 4×50 mm保护柱;使用氢氧化钠/醋酸钠梯度洗脱,以多糖抗原标准溶液质量浓度为横坐标,其相应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,并对建立的方法进行专属性、精密度和准确性验证;同时与传统方法的检测结果进行比较分析。结果 A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖质量浓度在0.5～27.0μg/m L范围内与峰面积均具有良好线性关系,r=0.999。该方法专属性高,分析结果重复性良好,RSD均5%;回收率均在95%～105%范围内;与传统的火箭免疫电泳法相比,检测结果差异均无统计学意义(P0.05)。结论 HPAEC-PAD准确、可靠,重复性好,可用于检测脑膜炎球菌多糖原液及疫苗成品中的多糖含量。     

速率比浊法检测ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中各群多糖含量

目的建立速率比浊法准确检测ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗(group ACYW135 meningococcal conjugate vaccine)的各群多糖含量。方法制备多糖参考品和抗血清,建立检测ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗各群多糖含量的速率比浊法,对建立的方法进行验证及初步应用。结果①建立的方法具备高度的特异性,各群血清仅与本群多糖抗原发生特异性反应,与非本群多糖抗原无交叉反应;②在质量浓度为0.5～5.0μg/mL多糖参考品检测区间线性良好,相关系数r>0.98;③各群血清的最低检测限均低于质量浓度为0.35μg/mL;④批内和批间变异系数(CV)值分别为0.83%～5.34%和2.33%～13.88%,加样回收率为90.5%～118.4%,精密度和准确度均符合常规质量控制要求;⑤初步应用结果显示,建立的方法可准确检测疫苗的各群多糖含量,且与火箭电泳法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论建立的方法简便快捷、灵敏准确、自动化程度高,可有效检测ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗的各群多糖含量。     

疫苗中残余CDAP检测方法的建立

为了对多糖活化剂———1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)的残余水平进行有效监控,本研究建立了基于高效阳离子交换层析的简便易行的检测方法,进行验证后的结果表明,该法具有良好的专属性、准确度、精密度,检出限可低至16μg/L,在20～100μg/L的范围内具有良好的线性。     

离子色谱法测定ACYW135群脑膜炎球菌结合物中Y群及W135群多糖含量

目的利用离子色谱法即高效阴离子交换柱层析—脉冲安培检测法(HPAEC-PAD),测定ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖含量的方法,并加以验证。方法将ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖用三氟乙酸(TFA)水解为特异性单糖(葡萄糖、半乳糖),并去除水解液中残留的TFA,用HPAEC-PAD分析检测,用PA10糖分析柱分离单糖,电化学检测器测定葡萄糖及半乳糖含量,用Chromeleon色谱工作站记录并分析数据。对上述方法进行专属性、准确性、重复性验证,确定该方法的检出限和定量限。结果 Y群和W135群多糖在TFA2.5 mol/L(终浓度)、90℃、4 h可完全水解为葡萄糖、半乳糖。对照品葡萄糖及半乳糖在0.10~60.00μg/m L范围内,质量浓度和色谱峰面积呈较好的线性关系,r均大于0.99,回收率为87.94%~109.80%,相对标准偏差(RSD)为1.00%~2.00%,检出限为0.05μg/m L(信噪比3∶1),定量限为0.10μg/m L(信噪比10∶1)。结论离子色谱法可同时检测脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群糖含量,该方法操作简便、灵敏、快速,干扰小,重现性好,适用于对相关疫苗生产过程中的质量控制。     

肠道病毒71型灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法的建立及应用

目的 建立肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV-A71)灭活疫苗(Vero细胞)抗原含量检测方法并对其进行方法学验证及初步应用。方法 以抗EV-A71兔多克隆抗体为包被抗体，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的抗EV-A71鼠单克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA并验证其线性范围、专属性、准确度、精密度及耐用性等。通过检测EV-A71疫苗原液及研发生产工艺各中间制品的EV-A71抗原含量评价该方法的适用性。结果 包被抗体与酶标抗体最佳稀释度分别为1∶5 000和1∶10 000。抗原为5～80 U/mL时，线性良好；与同为肠道病毒的其他抗原不存在交叉反应，专属性良好；对不同浓度抗原进行6次测定，其回收率在90%～100%,准确度良好；不同实验员对不同浓度抗原样品检测3次，CV均<11%,精密度良好；针对不同影响因素设计耐用性试验，回收率均在80%～120%,耐用性良好。该方法检测EV-A71疫苗原液和制备过程中的中间制品均具有良好的线性和平行性，表明该方法具有良好的适用性。结论 建立了EV-A71疫苗(Ve...     

分子排阻高效液相色谱法检测促胰岛素分泌肽融合蛋白纯度

目的建立检测促胰岛素分泌肽融合蛋白(Exendin-4-Fc fusion protein,简称E4F4)纯度的分子排阻高效液相色谱法(size exclusion high performance liquid chromatography, SEC-HPLC),并对该方法进行验证。方法使用Waters 515系列高效液相色谱仪,利用TSK G2000SW_(XL)色谱柱检测E4F4的纯度,并从系统适应性、专属性、重复性和中间精密度进行验证,同时使用20、50、100 mmol/L磷酸盐缓冲液的流动相对样品进行了6次纯度检测。结果空白溶剂在目标峰积分范围内无干扰峰;专属性验证表明样品与阴性对照分离度良好;6次重复进样目标峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.49%,保留时间RSD为0.11%;中间精密度分析目标峰面积RSD为0.47%,保留时间RSD为0.48%;使用不同盐浓度(20～100 mmol/L PBS, pH 6.8)的流动相对样品进行6次纯度检测后,各样品纯度均大于99.0%,目标峰面积RSD为0.53%,保留时间RSD为0.76%。结论经验证,建立的SEC-HPLC法各项指标均符合要求,可用于E4F4的纯度检测。     

肺炎链球菌C多糖含量检测方法的建立

目的使用肺炎链球菌C多糖单克隆抗体(单抗),建立检测荚膜多糖中残留的C多糖含量的方法。方法选择BALB/c雌性小鼠,采用体内诱生单抗腹水,放大生产肺炎链球菌C多糖单抗;使用间接ELISA、抑制性ELISA对其进行特异性鉴定;用特异性和亲和力高的单抗尝试建立肺炎链球菌荚膜多糖中C多糖含量检测的速率比浊法,并对该方法的线性、精密度、特异性进行验证。结果所制4株单抗的抗体类别均为IgM,识别的抗原表位互不相同,亲和力也不同。间接ELISA、抑制性ELISA结果均显示,所获得的单抗能够作用于肺炎链球菌C多糖上的磷酸胆碱位点,具有很好的特异性。选择单抗E8建立速率比浊检测方法的线性、精密度和特异性均良好,检测结果表明肺炎链球菌23个血清型荚膜多糖中C多糖含量不同。结论利用单抗建立了检测肺炎链球菌荚膜多糖中残留的C多糖的含量的速率比浊法。     

顶空气相色谱法测定四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环

目的建立并验证四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环的检测方法。方法采用顶空气相色谱法,样品中加入碳酸钠固体,产生"盐析"效应,以增加二氧六环在顶空瓶中的浓度。通过HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm,5%Phenyl Methyl-Siloxane),氢火焰检测器测定四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环。结果二氧六环平均回收率及变异系数分别为86.16%～106.54%和2.4%～8.7%,在0.5004～40.032mg/L范围内相关系数值r=0.999 41,线性关系好,最低检测限为0.5 mg/L,最低定量限为2.5 mg/L。结论该方法溶剂用量少、灵敏度高、出峰特异、专属性强、色谱峰型好、分离度高、出峰时间短、影响因素少,是一种易于实现仪器自动化的分析方法。     

质控血清09CS中13个肺炎球菌荚膜多糖抗体IgG含量检测范围的确定

目的 建立09CS作为质控血清用于13价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗(13PCV)临床血清样本检测中的检测值范围。方法 用WHO推荐的检测人血清中抗肺炎球菌荚膜多糖抗体IgG的定量ELISA,以国际人肺炎球菌标准血清007sp为标准,将09CS作为待测血清,检测其在13个血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型)中抗荚膜多糖抗体IgG含量的值。连续检测09CS血清100余次,计算99%置信区间的各血清型几何平均抗体浓度、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。结果 检测得到09C中13个血清型抗荚膜多糖IgG抗体含量以及在99%置信区间(CI)下±2.58倍SD的检测值范围;13个血清型检测结果的CV分别为10.86%、12.52%、13.96%、14.98%、28.77%、11.16%、14.96%、9.31%、10.43%、7.28%、10.86%、12.52%、13.96%,除6A型外,各型CV均低于15%,表明试验间精密度良好;检测次数异常率低于10%。结论 09CS可作为质控血清,用于13价肺炎球菌结合疫苗临床血清中抗荚膜多糖抗体IgG含量的ELISA检测。     

用高效液相色谱测定重组人尿激酶原制剂的蛋白含量

目的:用RP-HPLC方法对注射用重组人尿激酶原制剂蛋白含量进行定量分析。方法:用反相C18柱、0.1%TFA水溶液与0.1%乙腈进行梯度洗脱,280nm波长紫外检测器监测;以重组人尿激酶原同质标准品作为对照品,根据进样量和相应的峰面积建立标准曲线方程,将待测定样品的峰面积代入标准曲线方程,可测得蛋白含量。结果:按照方法学验证要求对此方法进行了专属性、检测限、定量限、线形、精密度(重复性、中间精密度)、准确度(回收率)考察,线性范围为9～27μg,回收率在97%以上,RSD2.0%,完全满足对制剂蛋白的定量需求。结论:本方法准确,适用于注射用重组人尿激酶原成品制剂蛋白定量测定。     

不同产地枸杞子中多糖含量的比较研究

目的：建立枸杞子中多糖的测定方法，比较不同产地枸杞子中多糖含量的差异。方法：采用蒽酮-硫酸法测定宁夏、青海、新疆等3个产地86批次枸杞子中多糖的含量，分析差异，并进行方法学考察。结果：方法线性关系、回收率、精密度及重复性测定结果均符合要求，不同产地枸杞子中多糖含量范围为1.71%～4.56%，多糖含量高低顺序为青海>新疆>宁夏。结论：蒽酮-硫酸法可用于枸杞子多糖含量的测定，不同产地的枸杞子中多糖含量有一定差异，其中青海产地枸杞子中的多糖含量最高。     

双波长微孔板赖氏法检测人血浆丙氨酸氨基转移酶含量的方法学验证

目的采用双波长(492 nm/630 nm)微孔板赖氏法检测人血浆中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)的含量,并对该方法进行系统性的评价。方法按照ALT测定试剂盒的要求加样,应用双波长(492 nm/630 nm)微孔板赖氏法测定人血浆中的ALT含量,并对检测系统的专属性、线性范围、准确度和精密度进行验证。结果专属性分析结果显示,血浆样品与不同比例的抗凝剂混合,其中的ALT均能有效被检出,回收率分别为100%、95%和90%;对28和150个单位丙酮酸钠标准溶液进行倍比稀释5个梯度以制作标准曲线,采用多项式对标准曲线进行拟合,结果显示丙酮酸钠标准溶液分别在9.375～150、1.75～28和1.75～150个单位范围内线性关系均良好,相关系数r均达到0.99以上;准确度检测结果显示,已知含量的厂家质控血清和国家能力验证样品的实测值和理论值相比,回收率均在90%～110%之间;同一样品,重复加样18孔,重复性检测结果变异系数(CV)为5.29%;两位试验人员在不同日期对同一样品重复测定6次,中间精密度检测结果变异系数为5.49%。结论该检测方法专属性强、检测结果稳定可靠、线性良好、重复性好、检测通量大,可以有效降低成本,提高工作效率,适用于大规模检测人血浆中ALT的含量。     

气相色谱法检测水痘减毒活疫苗原液中二甲基亚砜残留量

目的 建立测定水痘减毒活疫苗原液中二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)残留量的气相色谱法,并进行方法学的验证和初步应用。方法 采用气相色谱法检测,对色谱柱、柱温、分流比以及供试品预处理方法进行了优化,并对优化后的方法进行系统适用性和专属性、线性和范围、准确度和精密度、定量限和检测限、耐用性的方法学验证。结果 色谱柱使用DB-624(30 m×0.53 mm, 3.00μm)毛细管柱,以氮气为载气,进样口温度设定为250℃,FID检测器温度设定为270℃,柱温为120℃,分流比为5∶1。供试品在检测前采用乙腈沉淀蛋白的预处理方式(体积比1∶9～1∶19)以去除其中的干扰杂质。方法学验证结果显示,系统适用性和专属性良好,DMSO色谱峰与杂质分离良好,在50～1 000μg/mL范围内线性关系良好(R²=0.999 9)。检测限为20μg/mL,定量限为50μg/mL;准确度结果均在90%～110%之间,精密度的RSD均<10%。水痘减毒活疫苗原液中的DMSO残留量均未检出。结论 建立的气相色谱法能稳定、准确、快速地检测水痘减毒活疫苗原液...     

宣木瓜中多糖含量测定

目的:建立宣木瓜中多糖含量的测定方法,并测定不同采收时期的宣木瓜多糖含量。方法:在同一种植基地定期采集同一宣木瓜品种果实,以葡萄糖为对照品,采用分光光度法,以苯酚—浓硫酸为显色剂,在490 nm波长处测定吸光度,计算样品中多糖含量。结果:宣木瓜果实在生长过程中,其多糖含量在2.51%~5.08%之间,并于7月8日含量最高为5.08%。结论:本文建立的宣木瓜多糖含量的测定方法简便灵敏,精密度高,重现性好,稳定可靠;若要利用多糖含量高的宣木瓜,应适宜于7月上旬或中旬采收。     

Hib多糖蛋白结合疫苗中残余氰化物检测方法的建立

为了保证多糖蛋白结合疫苗的生产质量,建立了高效离子色谱和电化学检测残余溴化氰(CNBr)的方法。结果显示,该方法用于Hib多糖蛋白结合疫苗的残余氰化物检测时,在10~100μg/L的测定范围内,具有良好的专属性、灵敏度、精密度、线性和准确度。该方法操作简便,检测时间仅需要10 min。该方法也适用于以溴化氰作为多糖活化剂的其他多糖蛋白结合疫苗的质量控制。     

2013—2018年上海市闵行区老年人接种23价肺炎球菌多糖疫苗的异常反应监测

目的评估2013年9月15日—2018年8月31日期间,上海市闵行区≥60岁老年人群接种1剂23价肺炎球菌多糖疫苗后的安全性。方法采用主动监测和被动监测,对接种过1剂23价肺炎球菌多糖疫苗的≥60岁老年人群进行疑似预防接种异常反应(adverse events following immunization,AEFI)监测。结果主动监测的AEFI报告发生率为167.64/10万,未见罕见严重AEFI;被动监测AEFI报告发生率为41.86/10万,主要为一般反应(36.84/10万),以局部红肿和发热为主。54.00%的AEFI发生在疫苗接种后24 h内,且一般反应持续时间均未超过3 d。AEFI报告发生率为2.50/10万,为血管水肿和淋巴结肿大。经统计学分析,主动监测和被动监测的AEFI报告发生率,差异无统计学意义(χ2=4.337、P>0.05)。结论 23价肺炎球菌多糖疫苗具有良好的安全性,可以在老年人群中大规模接种。