减毒活疫苗中逆转录酶活性检测

逆转录酶 (RT)是目前发现的所有逆转录病毒的一个重要标志 ,凡是逆转录病毒均携带逆转录酶 ,逆转录酶活性的测定可以反映出制品中是否有逆转录病毒的污染 ,不受病毒基因序列的影响。采用PCR法进行逆转录酶活性检测方法 ,以整个生活周期中无DNA过程的MS2RNA为模板 ,设计一对引物 ,在逆转录系统中加入待检样品 ,经过RT PCR扩增后 ,放大检测对象物进行观察 ,从而了解制品中是否存在逆转录酶的污染 ,继而间接推测其是否污染逆转录病毒。对不同生物制品厂家生产的减毒活疫苗的逆转录酶活性进行检测 ,发现在一些疫苗里有逆转录酶活性阳性。     

逆转录病毒介导myostatin在鸡胚胎中的过表达与检测

鸡的胚胎已经成为发育生物学、免疫学和癌症等学科的重要实验模型之一。以鸡胚胎为实验模型,以鸡myostatin为靶基因,利用逆转录病毒介导和原位杂交技术相结合的方法来研究目的基因的鸡胚胎转导和检测分析。实验结果表明：逆转录病毒介导的目的基因myostatin能够有效整合到胚胎基因组中,且具有转录活性;胚胎原位杂交检测能够准确直观的反映病毒的整合部位和转入基因的表达水平。不但为进一步研究鸡myostatin基因在胚胎发育中的功能奠定基础,同时在方法上也进行了简单的优化尝试。     

重组anti－CD20 scFv／CD80／CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建及其在Jurkat细胞株中的表达

目的:构建表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ重组非复制型逆转录病毒,转染Jurkat细胞株使其表达目的蛋白.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,收获上清液获非复制型逆转录病毒,感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞的表达情况,确定病毒滴度.挑取高滴度的包装细胞株收获病毒,感染Jurkat细胞,经G418筛选细胞,用RT-PCR检测目的基因表达情况.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建; 用PCR能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段; 流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白; 经RT-PCR,能够从转染的Jurkat细胞株中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在Jurkat细胞中表达目的蛋白.     

人IL-12重组逆转录病毒载体在HeLa细胞中的表达

目的:包装携带人白细胞介素12(IL-12)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究.方法:携带IL-12的逆转录病毒重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装,G418筛选.在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定.然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa.PCR、RT-PCR方法检测IL-12基因在HeLa中的整合和表达情况.结果:重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现IL-12基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录.结论:成功包装了携带IL-12基因的逆转录病毒,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的基因IL-12在细胞中表达,为今后IL-12基因治疗宫颈癌的研究奠定基础.     

重组逆转录病毒介导的转蚓激酶基因兔

目的通过重组逆转录病毒介导获得转蚓激酶基因家兔。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清直接注射雄性兔的睾丸组织转染精原干细胞。结果病毒上清经NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。病毒注射3月龄兔睾丸组织,过1.5个月取其睾丸、肾、脾、肝、肺进行组织切片观察,结果正常。提取交配所得F0、F1代仔兔基因组,经PCR、Southern检测,转基因阳性率F0代为6.3%(2/32)、F1代为15.3%(2/13)。结论通过重组逆转录病毒直接注射3月龄兔睾丸组织可获得转基因兔,病毒对兔的脏器无损害。     

白细胞介素6重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性过表达大鼠IL-6基因的重组逆转录病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾HEK293细胞中检测IL-6的表达。方法以大鼠骨髓间充质干细胞mRNA为模板,经PCR获得目的基因IL-6,将其定向克隆到逆转录病毒载体pSEB-3H中,构建重组逆转录病毒质粒pSEB—IL-6,经脂质体分别转染到PC12细胞和HEK293细胞中,应用Real—timePCR和ELISA的方法在mRNA和蛋白质水平检测IL-6的表达变化。继而用HEK293细胞中包装获得的含有pSEB—IL-6的病毒颗粒进一步感染PC12细胞,Real—timePCR检测,IL-6mRNA的表达水平变化。结果PCR电泳及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒载体中,其基因序列与Genbank报道一致;Real—timePCR和ELISA结果均显示,逆转录病毒质粒pSEB—IL-6转染PC12细胞和HEK293细胞后,IL-6的表达水平较对照组显著上调;经pSEB—IL-6逆转录病毒颗粒感染的PC12细胞中,IL-6mRNA表达水平较对照组提高4倍。结论成功构建了特异性表达大鼠儿-6基因的重组逆转录病毒载体pSEB—IL-6,并获得了具有感染能力的逆转录病毒颗粒,感染真核细胞后可高表达IL-6,为进一步研究IL-6的功能及其在多种疾病中的免疫调节机制提供重要的分子手段。     

骨形成蛋白7基因诱导人肝癌细胞的凋亡

目的 构建表达重组人骨形成蛋白7 （bone morphogenic protein 7, BMP7）基因的重组逆转录病毒,观察其对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导活性,并探讨其作用机制。方法 克隆BMP7基因,以loxP同源重组法构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP7（pLLBMP7）,转染包装细胞PT67进行病毒包装并测定病毒滴度;将逆转录病毒感染人成骨细胞,MTT法检测细胞生长变化,琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;Western blotting检测BMP7,caspase-3和bcl-2蛋白表达。结果 重组逆转录病毒载体pLLBMP7经鉴定连接正确,转染PT67细胞后上清液中可得到病毒,滴度达1×109pfu;MTT检测见pLLBMP7病毒组48和72h细胞抑制率高于对照组（35.1% vs. 5.3%,68.5% vs.18.3%,均p<0.05）,48h可见BMP7蛋白高表达。琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,于转染48h后达最高峰,其凋亡百分率高达14.42%;BMP7蛋白高表达时caspase-3蛋白的表达亦有显著升高,但bcl-2蛋白未见表达差异。结论 构建了BMP7逆转录病毒,在体外能够有效地诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡,其可能是通过激活caspase-3而发生作用。     

DNA免疫诱导的病毒特异性CTL反应

ＤＮＡ免疫可诱导抗多种不同病毒的特异性ＣＴＬ反应,包括ＤＮＡ病毒,ＲＮＡ病毒和逆转录病毒。在病毒Ｔ细胞表位５‘端插入内质网信号识别序列可大大增强诱导ＣＴＬ反答的能力。在病毒感染的防治,尤其在持续性病毒感染中,ＤＮＡ免疫诱导的ＣＴＬ对清除病毒感染具有重要意义。     

逆转录病毒载体用于基因治疗的安全性

有复制能力的逆转录病毒感染,插入突变,无关序列进入靶细胞是基因治疗潜在的危险,但造成实际危害的可能性极小,完善逆转录病毒载体系统的设计,提高检测有复制能力的病毒的灵敏度将进一步保证基因治疗的安全性。     

用“乒乓效应”提高包装细胞培养上清中逆转录病毒滴度的方法

逆转录病毒是基因治疗研究中最为主要的基因转移载体,目前批准的基因治疗试验方案中绝大多数采用逆转录病毒作为载体。逆转录病毒具有稳定、安全、高效的优点,但仍存在病毒滴度低的问题。目前多从质粒结构和病毒包装两方面来提高病毒滴度。 将HyTK基因替换逆转录病毒载体GlNa