应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。     

大肠杆菌Nissle1917 L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大肠杆菌BL21中的表达与抗肿瘤活性

【目的】从大肠杆菌Nissle1917中获得L-天冬酰胺酶Ⅱ基因,并研究其抗肿瘤活性。【方法】以大肠杆菌Nissle1917基因组为模板PCR扩增L-天冬酰胺酶Ⅱ基因,克隆至可诱导表达载体pET28a上。将L-天冬酰胺酶Ⅱ表达载体pET28a-asp转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相色谱-质谱(LC-MS)对表达的L-天冬酰胺酶Ⅱ进行鉴定,并通过镍柱亲和层析纯化收集表达出的L-天冬酰胺酶Ⅱ。用纯化定量以后的L-天冬酰胺酶Ⅱ作用小鼠乳腺癌4T1细胞、人肝癌Hep-3B细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC。【结果】来自于大肠杆菌Nissle1917的L-天冬酰胺酶Ⅱ基因可在大肠杆菌BL21中高效表达并通过LC-MS得到鉴定,细胞毒性实验结果表明L-天冬酰胺酶Ⅱ对4T1细胞和Hep-3B细胞的生长具有较强的抑制作用,而对人脐静脉内皮细胞HUVEC的生长无明显抑制效果。【结论】来源于大肠杆菌Nissle1917的L-天冬酰胺酶Ⅱ能显著抑制4T1细胞和Hep-3肿瘤细胞的生长,而对人正常组织细胞的生长无明显抑制效果,为进一步研究L-天冬酰胺酶Ⅱ特异性抗肿瘤作用机制和对实体瘤的应用研究奠定了重要基础。     

不同来源的谷氨酸棒杆菌氨基脱氧分支酸合成酶的活性分析

分别以高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062与模式菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032的基因组DNA为模板,运用PCR技术扩增出氨基脱氧分支酸合成酶(ADC synthase)的编码基因pabAB。实验结果表明：来源于SYPS-062和ATCC 13032的pabAB片段全长均为1863bp,编码620个氨基酸。两片段存在16个碱基的差异,引起了7个氨基酸的突变。将pabAB连接表达载体pET-28a(+),构建表达质粒pET-28a-pabAB,并转化E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下,E.coli BL21(DE3)(pET-28a-pabAB)高效表达分子量约为67kDa的可溶性蛋白。表达产物带有His-tag标记,选用Ni柱对表达产物进行纯化,纯化后酶活测定结果表明,来源于SYPS-062氨基脱氧分支酸合成酶的比酶活低于ATCC 13032达46.6%。     

重组大肠杆菌生物转化甘油生产3-羟基丙酸

目的:以甘油为底物构建高效的3-羟基丙酸生产菌株。方法:以自身携带乙醛脱氢酶的E.coli BL21(DE3)plysS作为宿主,异源表达源自Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶基因dhaB。结果:重组菌E.coli HP获得的甘油脱水酶比活力在1.0mmol/L IPTG的诱导下达到了77.2 U/mg,摇瓶条件下,3-HP的最大产量为5.44 g/L,摩尔转化率为53%,该产量比目前报道的最高水平(4.4 g/L)提高了23.6%。结论:重组菌株E.coli HP实现了甘油向3-羟基丙酸(3-HP)的高效生物转化。     

γ-谷氨酰转肽酶在大肠杆菌周质空间的双融合表达

设计引物PCR扩增大肠杆菌Escherichia coli DH5α的γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)成熟肽的编码基因,利用基因拼接(gene splicing by overlap extension,SOE)技术将其拼接至小分子泛素相关修饰物(the small ubiquitin-related modifier,SUMO)基因的下游,并重组至pET-39b质粒中,重组质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。得到的工程菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,全菌SDS-PAGE分析,得到表观分子量约为97×103的双融合蛋白,DNA测序进一步证实工程菌构建成功。以菌体直接催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸,纸层析法证实该重组酶具有较好的活性,为酶法生产L-茶氨酸奠定基础。     

大肠杆菌BL21(DE3)膜组分相关基因的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响

摘要:【目的】探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waaF或msbB的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】运用Red重组技术将E.coli BL21 (DE3)染色体上的基因waaF或msbB敲除,构建敲除菌株E.coli BL21(ΔwaaF)、E.coli BL21(ΔmsbB)。将本实验室保存的带有β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)、青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase,PGA)基因的重组质粒pET-ffase、pET-pga分别转入敲除菌株及出发菌株中,构建工程菌株E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase、E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-ffase、E.coli BL21(DE3)/pET-ffase、E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-pga、E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-pga、E.coli BL21(DE3)/pET-pga。最后通过摇瓶发酵研究敲除菌株对β-FFase、PGA胞外分泌的影响。【结果】当诱导表达4 h,以出发菌株E.coli BL21(DE3)为宿主时,β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌量占总表达量的2.6%,以敲除菌株ΔmsbB为宿主时,胞外分泌量达到19.7%,而以敲除菌株ΔwaaF为宿主时,胞外分泌量达到50.9%。另外,当诱导表达24 h,以敲除菌株ΔwaaF为宿主时,青霉素G酰化酶PGA的胞外酶活是出发菌株中的4.1倍,达到1708 U/L。【结论】本研究成功构建了敲除菌株ΔmsbB和ΔwaaF,ΔmsbB能明显增强β-FFase的胞外分泌,而ΔwaaF对β-FFase和PGA的胞外分泌均有显著的强化作用。     

嗜热古菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的序列分析、基因克隆与异源表达

将Methanopyrus sp.SNP6进行功能基因组测序,获得S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam)序列,并进行序列分析。将sam基因扩增后连接至表达质粒p ET-28b(+),转化E.coli BL21(DE3),获得重组菌后进行诱导表达。生物信息学分析表明,sam基因编码蛋白的理论分子量为44 086.4Da,三级结构为同源四聚体,与其他相关古菌来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的蛋白序列较保守。实验结果显示,构建的重组表达质粒p ET28b(+)-sam可在E.coli BL21(DE3)宿主菌中高水平表达。重组蛋白的分子量与预期值基本一致,部分为胞内可溶性表达,另一部分以包涵体形式存在。本研究首次实现了Methanopyrus sp.SNP6菌株S-腺苷甲硫氨酸合成酶的异源表达,为后期的蛋白纯化、酶学性质研究和酶促转化法生产S-腺苷甲硫氨酸奠定了理论基础。     

利用Duet系列共表达载体构建工程菌生物合成3-羟基丁酸(3HB)

通过PCR获得β-酮基硫解酶(PhaA)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(PhaB)和硫酯酶(TesB)的基因phaA,phaB和tesB。以pACYCDuet-1、pRSFDuet-1、PET30a(+)为载体,以大肠杆菌表达型宿主E.coli BL21(DE3)为宿主茵,分别构建了两株表达体系不同的工程茵,建立了R-3-羟基丁酸(3HB)的代谢途径,实现3HB的生物合成。将两株工程茵分别进行诱导表达及发酵,结果表明,三个基因均可在表达型宿主BL21(DE3)中进行活性表达,通过三个酶的连续催化生物合成3HB,并且三个基因的均衡表达更有利于3HB的生物合成。将phaAB基因簇构建在ACYCDuet-1上,tesB基因构建在RSFDuet-1上,获得的工程茵BL21(AAB+RB),3HB产量可达到1.8 g/L。     

荧光假单胞菌天冬氨酸转氨酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用克隆基因测序技术,从荧光假单胞菌GcM5-1A基因组文库中筛选到了天冬氨酸转氨酶的编码基因aspC。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因,插入pET-15b构建重组表达质粒pET-15bAAT,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中高效表达,利用亲和层析法初步分离纯化了重组蛋白。生物活性分析表明,纯化的重组天门冬氨酸转氨酶具有氨基转移活性。     

改造大肠杆菌合成海藻糖途径以高效合成海藻糖

海藻糖是相容性溶质的一种,因其具有多种生物学功能,在食品、化妆品、药品以及器官移植等方面均有很广泛应用。然而近几年生产海藻糖主要集中在使用酶催化的方法,虽然这种方法的转化效率高,但是却存在着副产物的问题,难以得到高纯度的海藻糖产品,严重制约了海藻糖的应用。本文通过基因工程技术在大肠杆菌Escherichia coli中构建了海藻糖高效合成新途径,通过全细胞催化合成海藻糖。利用PCR技术在哈氏噬纤维菌Cytophaga hutchinsonii中克隆获得海藻糖双功能合成酶基因(tpsp),采用E.coli pTac-HisA高效表达载体,实现海藻糖双功能合成酶基因(tpsp)高效表达,利用高效表达菌株进行全细胞催化,将葡萄糖高效转化为海藻糖。结果表明C.hutchinsonii海藻糖合成酶基因(tpsp)在E.coli中成功实现表达,该酶能够在胞内将葡萄糖高效转化为海藻糖,并将其转运到胞外,实现海藻糖的高效率合成,海藻糖的产量提高到1.2 g/L,相对转化率为21%。当将此高产菌株在发酵罐中进行转化时,海藻糖的产量达到13.3 g/L,葡萄糖的相对转化率达到48.6%。采用C.hutchinsonii海藻糖合成酶基因高效表达并且应用于海藻糖全细胞合成催化在国内外尚属首次报道,海藻糖的转化率及产率都已达到文献报道最高水平,本研究为开拓海藻糖生产新技术奠定了基础。     

海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶基因xynB64在大肠杆菌中的融合表达

来源于极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima MSB8)的木聚糖酶B具有极高的热稳定性,在饲料、造纸、能源和食品医药行业具有巨大应用潜力。携带酶基因xynB64的pET28a(+)重组载体在宿主大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,重组酶活力较低。更换宿主为携带稀有tRNA基因的大肠杆菌:BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL和Rosetta(DE3)后,酶活力分别提高了197%和277%,但是后者中的表达会形成部分包涵体。宿主菌为大肠杆菌Rosetta(DE3),更换载体为4种融合表达载体pET32a(+)、pET42a(+)、pET43.1a(+)和pMAL-c2X进行表达,重组酶分别融合了Trx、GST、Nus和MBP标签。其中Rosetta(DE3)/pMAL-c2X-xynB64表达酶活力最高,相当于Rosetta(DE3)/pET28a-xynB64表达酶的88%,而且目的酶表达量占全细胞蛋白的40%,几乎不形成包涵体。     

Efficient expression of membrane-bound water channel protein (Aquaporin Z) in Escherichia coli

In order to explore the possibility of preparing a high-efficiency aquaporin-based biofilter, an efficient approach for expression of membrane-bound Aquaporin Z (AqpZ) in E. coli was proposed. The AqpZ gene was amplified by means of PCR, and two expression vectors (pET28-AqpZ and pET32-AqpZ) were constructed. The channel protein of interest was synthesized in E. coli BL21(DE3)/pET32-AqpZ as an insoluble fusion protein linked with trxA. However, with BL21(DE3)/pET28-AqpZ, significant amount of AqpZ fused only with 6-His (6-His-AqpZ) could be expressed, correctly folded and targeted into the membrane. Under the optimized culture conditions, the highest expression level (9.05 mg/l) of membrane-bound 6-His-AqpZ was achieved with BL21(DE3)/pET28-AqpZ, and an additional amount (2.35 mg/l) was expressed concomitantly as the inclusion body form. This expression result was 3.5 times higher than that in the previous studies.     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表达及乳糖自诱导发酵

为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶,克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla,分别使用pET-28a(+)和pET-20b(+)载体,实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3)中的功能表达.重组菌利用载体pET-28a(+)在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL,占总酶活的91％.重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖0.8 g/L,乳糖5 g/L,25 mmol/L Na2HPO4,25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4;菌体生长6h后,添加7.5 g/L的甘氨酸,37℃恒温发酵24 h,重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL.     

表达人胰高血糖素样肽前药工程菌遗传稳定性

通过传代培养的方法,研究高表达重组人胰高血糖素样肽前药(Pro-rhGLPs)的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs的遗传稳定性,观察菌体和菌落形态,比较在有无选择压力下的质粒稳定性,酶切和测序鉴定重组基因片断的正确性,SDS-PAGE电泳证实重组蛋白质的表达量的稳定性,在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测重组蛋白生物学活性。结果显示:此工程菌连续传代过程中,保持大肠杆菌的典型特征,各代质粒的酶切鉴定和测序正确,重组蛋白表达水平及生物活性也无显著差异。因此,工程菌E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs具有良好的遗传稳定性。     

果胶裂解酶基因PelC表达载体的构建及原核表达分析

从实验室分离保存的1株产果胶酶的菌株（BTC105）中克隆果胶裂解酶基因（PelC）完整开放阅读框,通过载体构建,将目的基因连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希茵BL21（DE3）进行融合表达,在LB（Luria—Bertani）中进行摇瓶发酵,1mmol／LIPTG（异丙基－β－D－硫代半乳糖苷）诱导。结果表明,拘建了表达载俸pET28a－felC,果胶裂解酶主要在胞内表达,酶活最适pH为5．4,最适温度为50℃,Ca^2＋对酶活促进作用最为明显,Cu^2＋完全抑制了酶的活性。     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。